Un microscopio, derivado de los términos griegos antiguos μικρός (mikrós), que significa 'pequeño', y σκοπέω (skopéō), que significa 'mirar, examinar o inspeccionar', funciona como un aparato de laboratorio diseñado para el examen. de especímenes imperceptibles al ojo humano sin ayuda. La disciplina científica dedicada a la investigación de estructuras y objetos diminutos mediante la aplicación de un microscopio se denomina microscopía. En consecuencia, el adjetivo "microscópico" denota una entidad que permanece invisible sin la ayuda de un microscopio.
Los microscopios se clasifican según varios esquemas de clasificación. Un método frecuente implica distinguir los instrumentos en función de su interacción con una muestra para generar imágenes, lo que puede ocurrir mediante la transmisión de luz o haces de electrones a través de la trayectoria óptica de la muestra, la detección de emisiones de fotones de la muestra o el escaneo preciso de la superficie de una muestra en una proximidad cercana utilizando una sonda especializada. El microscopio óptico, históricamente el primero y aún el más utilizado, emplea lentes para refractar la luz visible que pasa a través de una muestra finamente preparada, creando así una imagen discernible. Otras categorías importantes incluyen el microscopio de fluorescencia, los microscopios electrónicos (que incluyen microscopios electrónicos de transmisión y de barrido) y diversas formas de microscopios de sonda de barrido.
Historial
Si bien los artefactos que se asemejan a lentes se remontan a cuatro milenios atrás, y los textos griegos del siglo V a. C. describen las características ópticas de las esferas llenas de agua, seguidos de siglos de tratados ópticos, la aplicación inicial documentada de microscopios simples o lupas coincide con la adopción generalizada de lentes para gafas en el siglo XIII. Los microscopios compuestos, que integran una lente objetivo colocada cerca de la muestra con un ocular para generar una imagen real, surgieron por primera vez en Europa alrededor de 1620. El inventor exacto sigue sin identificarse, a pesar de numerosas afirmaciones históricas. Muchas de estas afirmaciones se centran en centros holandeses de fabricación de espectáculos, lo que sugiere una invención en 1590 por Zacharias Janssen (como afirma su hijo) o su padre, Hans Martens, o ambos. Otras afirmaciones atribuyen la invención a su competidor, Hans Lippershey, quien presentó la patente inaugural del telescopio en 1608, o al expatriado Cornelis Drebbel, quien supuestamente poseía una versión en Londres en 1619. Galileo Galilei, a quien ocasionalmente se le atribuye la invención del microscopio compuesto, aparentemente descubrió después de 1610 que su telescopio podía reenfocarse para observar objetos diminutos. Tras observar un microscopio compuesto construido por Drebbel, expuesto en Roma en 1624, Galileo procedió a desarrollar su propio modelo mejorado. En 1625, Giovanni Faber designó formalmente el microscopio compuesto presentado por Galileo a la Accademia dei Lincei como un microscopio (el propio Galileo se había referido a él como el occhiolino, u "pequeño ojo"). René Descartes, en su obra Dioptrique de 1637, detalló diseños de microscopios que incorporaban un espejo cóncavo, orientado con su concavidad hacia el objeto, utilizado junto con una lente para iluminar la muestra, que estaba montada en el punto focal del espejo.
Evolución de la microscopía óptica moderna
La primera descripción exhaustiva de la anatomía microscópica del tejido orgánico, facilitada por la aplicación de un microscopio, se publicó en 1644 en el tratado de Giambattista Odierna, L'occhio della mosca, traducido como El ojo de la mosca.
Los microscopios siguieron siendo en gran medida una novedad hasta las décadas de 1660 y 1670, cuando los naturalistas de Italia, los Países Bajos e Inglaterra iniciaron su aplicación en los estudios biológicos. Marcello Malpighi, un científico italiano a quien algunos historiadores de la biología consideran el padre de la histología, comenzó su examen de las estructuras biológicas con los pulmones. La publicación de Robert Hooke de 1665, Micrographia, influyó significativamente en este campo, principalmente debido a sus notables ilustraciones. Hooke fabricó lentes diminutas a partir de pequeños glóbulos de vidrio, producidos fusionando los extremos de hilos de vidrio hilados. Antonie van Leeuwenhoek hizo una contribución notable al lograr un aumento de hasta 300x con un sencillo microscopio de lente única. Su diseño implicó intercalar una minúscula lente de bola de vidrio entre orificios en dos placas de metal remachadas, incorporando una aguja ajustable con tornillo para el montaje de la muestra. Posteriormente, Van Leeuwenhoek redescubrió de forma independiente los glóbulos rojos (siguiendo la observación anterior de Jan Swammerdam) y los espermatozoides, contribuyendo así a la popularización de los microscopios para visualizar la ultraestructura biológica. El 9 de octubre de 1676, van Leeuwenhoek documentó el descubrimiento de los microorganismos.
La eficacia de un microscopio óptico compuesto depende de la calidad y la aplicación precisa de su sistema de lentes condensadoras, que enfoca la luz en la muestra, y su lente objetivo, que captura la luz de la muestra para formar una imagen. Los primeros instrumentos exhibieron limitaciones hasta que este principio fundamental fue comprendido y perfeccionado a fondo desde finales del siglo XIX hasta principios del XX, y hasta que las lámparas eléctricas se volvieron accesibles como fuentes de iluminación. En 1893, August Köhler formuló un principio crucial de iluminación de muestras, conocido como iluminación de Köhler, que es indispensable para alcanzar los límites teóricos de resolución del microscopio óptico. Esta técnica de iluminación garantiza una iluminación uniforme y mitiga las limitaciones de contraste y resolución inherentes a los métodos de iluminación de muestras anteriores. Los avances posteriores en la iluminación de muestras incluyeron el descubrimiento del contraste de fase por Frits Zernike en 1953 y la iluminación de contraste de interferencia diferencial por Georges Nomarski en 1955; Ambas innovaciones permiten la obtención de imágenes de muestras transparentes y sin teñir.
Microscopios electrónicos
A principios del siglo XX, surgió una alternativa sustancial al microscopio óptico: un instrumento que emplea un haz de electrones en lugar de luz para generar imágenes. En 1931, el físico alemán Ernst Ruska, en colaboración con el ingeniero eléctrico Max Knoll, desarrolló el prototipo inaugural de microscopio electrónico, específicamente un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El microscopio electrónico de transmisión funciona según principios análogos a los de un microscopio óptico, pero sustituye la luz por electrones y las lentes de vidrio por electroimanes. La utilización de electrones, en lugar de luz, facilita una resolución significativamente mejorada.
El desarrollo del microscopio electrónico de transmisión fue rápidamente sucedido en 1935 por la invención de Max Knoll del microscopio electrónico de barrido. Si bien los TEM se emplearon para la investigación antes de la Segunda Guerra Mundial y ganaron gran popularidad a partir de entonces, el SEM no fue comercialmente accesible hasta 1965.
Los microscopios electrónicos de transmisión ganaron prominencia después de la Segunda Guerra Mundial. Ernst Ruska, mientras estaba en Siemens, diseñó el primer microscopio electrónico de transmisión comercial y, en la década de 1950, comenzaron importantes conferencias científicas dedicadas a la microscopía electrónica. En 1965, el profesor Sir Charles Oatley y su estudiante de posgrado Gary Stewart desarrollaron el primer microscopio electrónico de barrido comercial, que Cambridge Instrument Company comercializó con el nombre de "Stereoscan".
Un avance reciente en relación con la microscopía electrónica implica su capacidad para identificar virus. A medida que los microscopios electrónicos generan imágenes claras y visibles de orgánulos diminutos, eliminan la necesidad de reactivos para visualizar virus o células perjudiciales, ofreciendo así un método más eficiente para la detección de patógenos.
Microscopios de sonda de barrido
Entre 1981 y 1983, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer realizaron investigaciones en IBM en Zürich, Suiza, centrándose en el fenómeno del túnel cuántico. Su trabajo condujo al desarrollo de un microscopio de sonda de barrido funcional (SPM), un instrumento derivado de la teoría de túneles cuánticos, capaz de detectar fuerzas diminutas intercambiadas entre una sonda y una superficie de muestra. Este mecanismo se basa en la proximidad de la sonda a la superficie, lo que permite un flujo continuo de electrones y, por tanto, una corriente entre la muestra y la sonda. Inicialmente, el microscopio enfrentó escepticismo debido a sus intrincados fundamentos teóricos. Sin embargo, en 1984, Jerry Tersoff y D.R. Hamann, entonces en los Laboratorios Bell de AT&T en Murray Hill, Nueva Jersey, publicó artículos que correlacionaban exitosamente el marco teórico con los resultados experimentales del instrumento. Esta validación teórica fue seguida rápidamente por la introducción de instrumentos SPM comerciales en 1985, y en 1986, por la invención del microscopio de fuerza atómica (AFM) por Gerd Binnig, Calvin Quate y Christoph Gerber. Posteriormente, Binnig y Rohrer recibieron el Premio Nobel de Física por su trabajo pionero en el microscopio de sonda de barrido.
El avance continuo en el mecanizado de sondas y puntas ultrafinas ha facilitado el desarrollo continuo de nuevos diseños de microscopios de sonda de barrido.
Microscopios de fluorescencia
Los avances contemporáneos en microscopía óptica se centran predominantemente en la proliferación de la microscopía de fluorescencia dentro de la investigación biológica. A lo largo de las últimas décadas del siglo XX, especialmente durante la era posgenómica, surgieron numerosas metodologías para teñir estructuras celulares con fluorescencia. Estas técnicas abarcan principalmente la tinción química dirigida de componentes celulares específicos, como la utilización de DAPI para marcar el ADN; la aplicación de anticuerpos conjugados con reporteros fluorescentes; y la incorporación de proteínas fluorescentes, ejemplificada por la proteína fluorescente verde. Esta diversidad de fluoróforos permite el análisis a nivel molecular de la arquitectura celular en especímenes vivos y preservados.
La aparición de la microscopía de fluorescencia impulsó significativamente la evolución de un diseño de microscopio moderno prominente: el microscopio confocal. Marvin Minsky patentó el principio subyacente en 1957; sin embargo, la implementación práctica de esta técnica se vio limitada por el estado incipiente de la tecnología láser. No fue hasta 1978 que Thomas y Christoph Cremer desarrollaron con éxito el primer microscopio de barrido láser confocal funcional, lo que llevó a la rápida adopción de la técnica a lo largo de la década de 1980.
Microscopios de súper resolución
Una parte sustancial de la investigación contemporánea en microscopía óptica, particularmente a principios del siglo XXI, se centra en avanzar en el análisis de súper resolución para muestras marcadas con fluorescencia. Métodos como la iluminación estructurada pueden mejorar la resolución aproximadamente de dos a cuatro veces, mientras que técnicas como la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) logran resoluciones comparables a las de los microscopios electrónicos. Este progreso aborda el límite de difracción inherente a la luz o la excitación, que tradicionalmente restringe la resolución. Stefan Hell recibió el Premio Nobel de Química 2014 por su trabajo pionero en la técnica STED, compartiendo el premio con Eric Betzig y William Moerner, quienes adaptaron la microscopía de fluorescencia para la visualización de moléculas individuales.
Microscopios de rayos X
Los microscopios de rayos X son instrumentos especializados que emplean radiación electromagnética, generalmente dentro del espectro de rayos X suaves, para obtener imágenes de varios objetos. Los importantes avances tecnológicos en la óptica de lentes de rayos X a principios de la década de 1970 establecieron estos instrumentos como una solución práctica para la obtención de imágenes. Se utilizan con frecuencia en tomografía para generar reconstrucciones tridimensionales de objetos, incluidas muestras biológicas que no han sido sometidas a fijación química. Los esfuerzos de investigación actuales se centran en mejorar la óptica de los rayos X duros, que poseen capacidades de penetración superiores.
Tipos
Los microscopios se pueden clasificar en distintas clases según varios criterios. Un sistema de clasificación diferencia los instrumentos según el medio que interactúa con la muestra para producir una imagen, específicamente luz o fotones (microscopios ópticos), electrones (microscopios electrónicos) o una sonda física (microscopios de sonda de barrido). Un método de clasificación alternativo distingue los microscopios según su enfoque de análisis de muestras: ya sea a través de un punto de escaneo (por ejemplo, microscopios ópticos confocales, microscopios electrónicos de barrido y microscopios de sonda de barrido) o analizando simultáneamente toda la muestra (por ejemplo, microscopios ópticos de campo amplio y microscopios electrónicos de transmisión).
Tanto los microscopios ópticos de campo amplio como los microscopios electrónicos de transmisión emplean la teoría de lentes (lentes ópticas para microscopios ópticos y lentes electromagnéticas para microscopios electrónicos) para ampliar las imágenes producidas por ondas transmitidas a través de una muestra o reflejadas por ella. Las ondas utilizadas son electromagnéticas en los microscopios ópticos o haces de electrones en los microscopios electrónicos. Las capacidades de resolución de estos microscopios están limitadas por la longitud de onda de la radiación empleada para obtener imágenes, y las longitudes de onda más cortas permiten una resolución superior.
Los microscopios ópticos y electrónicos de barrido, como el microscopio confocal y el microscopio electrónico de barrido, utilizan lentes para dirigir un punto de luz enfocado o electrones hacia una muestra. Posteriormente analizan las señales resultantes de la interacción del haz con la muestra. Luego, este punto enfocado se escanea sistemáticamente a través de la muestra para examinar un área rectangular definida. La ampliación de la imagen se logra proyectando los datos adquiridos de una pequeña región de muestra escaneada en una pantalla comparativamente más grande. Estos microscopios están sujetos a las mismas limitaciones de resolución que los microscopios ópticos, de sonda y electrónicos de campo amplio.
Los microscopios de sonda de barrido analizan de manera similar puntos individuales dentro de una muestra y posteriormente escanean una sonda a lo largo de una región rectangular para construir una imagen. Dado que estos microscopios no dependen de la radiación electromagnética o electrónica para obtener imágenes, están exentos de las restricciones de resolución que afectan a los microscopios ópticos y electrónicos.
Microscopio óptico
El microscopio óptico, que representa el tipo de microscopio más antiguo y más frecuente, es un instrumento óptico equipado con una o más lentes que generan una imagen ampliada de una muestra colocada dentro de su plano focal. Estos microscopios suelen incorporar elementos refractivos, como vidrio, plástico o cuarzo, para dirigir la luz hacia el ojo del observador u otro detector sensible a la luz. Los microscopios ópticos basados en espejos funcionan según un principio análogo. Los microscopios ópticos estándar, que funcionan con luz visible, suelen alcanzar aumentos de hasta 1250 ×, con un límite de resolución teórico de aproximadamente 0,250 micrómetros o 250 nanómetros. Esta limitación inherente restringe el aumento práctico a alrededor de 1.500×. Si bien las metodologías especializadas, incluida la microscopía confocal de barrido y Vertico SMI, pueden superar esta ampliación, su resolución sigue limitada por la difracción. El empleo de longitudes de onda de luz más cortas, como la ultravioleta, ofrece un método para mejorar la resolución espacial de los microscopios ópticos, una capacidad que también ofrecen instrumentos como el microscopio óptico de barrido de campo cercano.
Sarfus representa una técnica óptica contemporánea que aumenta la sensibilidad de los microscopios ópticos convencionales, permitiendo la visualización directa de películas nanométricas (tan delgadas como 0,3 nanómetros) y nanoobjetos aislados (con diámetros tan pequeños como 2 nanómetros). Este método se basa en la aplicación de sustratos no reflectantes dentro de la microscopía de luz reflejada con polarización cruzada.
La luz ultravioleta facilita la resolución de características microscópicas diminutas y la obtención de imágenes de muestras que son visualmente transparentes. Por el contrario, la luz infrarroja cercana se puede emplear para visualizar circuitos integrados dentro de dispositivos de silicio adheridos, debido a la transparencia del silicio en estas longitudes de onda específicas.
La microscopía de fluorescencia utiliza un amplio espectro de longitudes de onda de luz, desde ultravioleta hasta visible, para inducir fluorescencia en muestras, permitiendo así la observación ya sea visualmente o a través de cámaras sensibles especializadas.
La microscopía de contraste de fases es una técnica de iluminación óptica que transforma cambios de fase sutiles en la luz que atraviesa una muestra transparente en variaciones discernibles de amplitud o contraste dentro de la imagen resultante. Este método elimina la necesidad de teñir los portaobjetos, permitiendo así el estudio del ciclo celular en células vivas.
El microscopio óptico convencional ha avanzado recientemente hacia el microscopio digital. En esta evolución, se emplea un sensor similar a los que se encuentran en las cámaras digitales para capturar una imagen, que posteriormente se muestra en un monitor de computadora, ya sea junto con la visualización ocular directa o como alternativa a ella. Estos sensores pueden incorporar tecnología CMOS o dispositivo de carga acoplada (CCD), dependiendo de la aplicación específica.
La microscopía digital, que emplea cámaras digitales sensibles con recuento de fotones, permite obtener imágenes con niveles de luz muy bajos, evitando así daños a muestras biológicas delicadas. Las investigaciones han demostrado que utilizar una fuente de luz que genere pares de fotones entrelazados puede minimizar aún más el riesgo de dañar las muestras más fotosensibles. En esta aplicación específica de imágenes fantasma para microscopía de fotones dispersos, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de los cuales exhibe una correlación espacial con un compañero entrelazado en el espectro visible, lo que facilita la obtención de imágenes eficientes mediante una cámara de conteo de fotones.
Microscopio electrónico
Los microscopios electrónicos comprenden principalmente dos tipos: microscopios electrónicos de transmisión (TEM) y microscopios electrónicos de barrido (SEM). Ambos sistemas utilizan una serie de lentes electromagnéticas y electrostáticas para enfocar un haz de electrones de alta energía en una muestra. En un TEM, los electrones atraviesan la muestra, un proceso análogo a la microscopía óptica fundamental. Este método requiere una preparación meticulosa de la muestra, ya que la mayoría de los materiales dispersan fuertemente los electrones. Además, las muestras deben ser excepcionalmente delgadas (menos de 100 nm) para permitir la penetración de los electrones. Las secciones transversales de células, cuando se tiñen con osmio y metales pesados, revelan claramente membranas de orgánulos y proteínas como los ribosomas. Esta técnica logra una resolución de 0,1 nm, lo que permite una visualización detallada de virus (20 a 300 nm) y cadenas de ADN (2 nm de ancho). Por el contrario, los SEM emplean bobinas de trama para escanear la superficie de objetos voluminosos con un fino haz de electrones. En consecuencia, las muestras no necesariamente requieren seccionamiento, aunque las muestras no conductoras pueden necesitar un recubrimiento nanométrico de metal o carbono. SEM facilita la obtención de imágenes rápidas de la superficie de las muestras, potencialmente dentro de un entorno de vapor de agua fino para evitar la desecación.
Sonda de escaneo
La diversa gama de microscopios de sonda de barrido se origina a partir de los numerosos tipos de interacciones que se producen cuando se escanea una sonda diminuta y se acopla con una muestra. Estas interacciones, o modos operativos, se pueden registrar o mapear en función de la ubicación de la superficie para generar un mapa de caracterización. Los tres tipos más frecuentes de microscopios de sonda de barrido incluyen los microscopios de fuerza atómica (AFM), los microscopios ópticos de barrido de campo cercano (NSOM o SNOM, también conocidos como microscopía óptica de barrido de campo cercano) y los microscopios de efecto túnel (STM). Un microscopio de fuerza atómica presenta una sonda fina, generalmente hecha de silicio o nitruro de silicio, fijada a un voladizo; esta sonda escanea la superficie de la muestra y se miden y mapean las fuerzas que median la interacción entre la sonda y la superficie. Un microscopio óptico de barrido de campo cercano comparte similitudes con un AFM, pero su sonda incorpora una fuente de luz dentro de una fibra óptica, que termina en una punta generalmente equipada con una abertura para la transmisión de luz. Este microscopio puede capturar luz transmitida o reflejada para evaluar propiedades ópticas altamente localizadas de la superficie, frecuentemente para muestras biológicas. Los microscopios de efecto túnel utilizan una punta de metal con un solo átomo apical; esta punta está unida a un tubo por el que fluye una corriente eléctrica. La punta se escanea sobre la superficie de una muestra conductora hasta que se establece una corriente de túnel; esta corriente se mantiene a un nivel constante mediante el movimiento de la punta controlado por computadora, y se construye una imagen a partir de los movimientos registrados de la punta.
Otros tipos
Los microscopios acústicos de barrido emplean ondas sonoras para cuantificar las variaciones en la impedancia acústica. Estos instrumentos, que funcionan según principios similares al sonar, se utilizan para tareas como la detección de defectos subterráneos en materiales, incluidos los que se encuentran en circuitos integrados. El 4 de febrero de 2013, ingenieros australianos desarrollaron un "microscopio cuántico" capaz de ofrecer una precisión incomparable.
Aplicaciones móviles
Los microscopios de aplicaciones móviles pueden funcionar como microscopios ópticos cuando se activa la linterna del dispositivo. Sin embargo, estos microscopios basados en aplicaciones móviles presentan desafíos de usabilidad debido al ruido visual, con frecuencia están limitados a un aumento de 40x y están limitados por las capacidades de resolución inherentes de la propia lente de la cámara.
Referencias
Referencias
Hitos en microscopía óptica, Nature Publishing
- Hitos en microscopía óptica, Nature Publishing
- Preguntas frecuentes sobre microscopios ópticos (archivada el 4 de abril de 2009)
- Nikon MicroscopyU, tutoriales proporcionados por Nikon
- Expresiones moleculares: Explorando el mundo de la óptica y la microscopía, Universidad Estatal de Florida.