Insulina (Insulin)

L'insulina (; dal latino insula 'isola') è un ormone peptidico sintetizzato dalle cellule beta all'interno delle isole pancreatiche, con la sua produzione nell'uomo codificata dal gene dell'insulina (INS). Funziona come il principale ormone anabolico del corpo. Il suo ruolo principale consiste nel regolare il metabolismo dei carboidrati, dei lipidi e delle proteine ​​facilitando l'assorbimento del glucosio dal flusso sanguigno nelle cellule muscolari epatiche, adipose e scheletriche. All'interno di questi tessuti, il glucosio assimilato viene trasformato in glicogeno attraverso la glicogenesi o in trigliceridi attraverso la lipogenesi; in particolare, nel fegato, si verificano entrambe le conversioni. Elevate concentrazioni di insulina nel sangue inibiscono significativamente la produzione e la secrezione epatica di glucosio. Inoltre, l’insulina circolante influenza la sintesi proteica in una vasta gamma di tessuti. Agisce quindi come un ormone anabolico, favorendo la conversione di molecole circolanti più piccole in macromolecole cellulari più grandi. Al contrario, livelli ridotti di insulina nel sangue inducono un catabolismo diffuso, con un impatto particolare sul grasso corporeo immagazzinato.

insulina ( ; dal latino insula 'isola') è un ormone peptidico prodotto dalle cellule beta delle isole pancreatiche codificate nell'uomo dal gene dell'insulina (INS). È il principale ormone anabolico del corpo. Regola il metabolismo dei carboidrati, dei grassi e delle proteine ​​favorendo l'assorbimento del glucosio dal sangue nelle cellule del fegato, del grasso e dei muscoli scheletrici. In questi tessuti il ​​glucosio assorbito viene convertito in glicogeno, tramite glicogenesi, o in grassi (trigliceridi), tramite lipogenesi; nel fegato, il glucosio viene convertito in entrambi. La produzione e la secrezione di glucosio da parte del fegato sono fortemente inibite da elevate concentrazioni di insulina nel sangue. L’insulina circolante influenza anche la sintesi delle proteine ​​in un’ampia varietà di tessuti. È quindi un ormone anabolico, che promuove la conversione di piccole molecole nel sangue in grandi molecole nelle cellule. Un basso livello di insulina nel sangue ha l'effetto opposto, promuovendo un catabolismo diffuso, in particolare del grasso corporeo di riserva.

Le cellule beta mostrano sensibilità alle concentrazioni di glucosio nel sangue, rilasciando insulina nel flusso sanguigno in risposta all'iperglicemia e sopprimendone la secrezione quando i livelli di glucosio sono bassi. La sintesi dell'insulina è modulata anche dal glucosio; concentrazioni elevate di glucosio stimolano la produzione di insulina, mentre livelli ridotti determinano una diminuzione della sintesi. L’insulina facilita l’assorbimento e il metabolismo del glucosio cellulare, riducendo di conseguenza la glicemia. Al contrario, le cellule alfa adiacenti, influenzate dall’attività delle cellule beta, secernono glucagone nel sangue secondo uno schema inverso: la secrezione aumenta durante l’ipoglicemia e diminuisce quando le concentrazioni di glucosio sono elevate. Il glucagone aumenta la glicemia stimolando la glicogenolisi epatica e la gluconeogenesi. La secrezione coordinata di insulina e glucagone nel flusso sanguigno, in risposta alla concentrazione di glucosio nel sangue, costituisce il principale meccanismo dell'omeostasi del glucosio.

Un'attività insulinica insufficiente o assente porta al diabete, una condizione medica caratterizzata da elevati livelli di glucosio nel sangue (iperglicemia). Questa malattia si manifesta in due forme primarie. Nel diabete di tipo 1, una reazione autoimmune provoca la distruzione delle cellule beta, impedendo così la sintesi e la secrezione di insulina nel flusso sanguigno. Al contrario, il diabete di tipo 2 comporta una distruzione delle cellule beta meno grave rispetto al tipo 1 e questo non è attribuito a un processo autoimmune. Invece, l’amiloide si accumula all’interno delle isole pancreatiche, il che si presume ne comprometta la struttura anatomica e la funzione fisiologica. Sebbene la patogenesi precisa del diabete di tipo 2 rimanga non completamente chiarita, si ritiene che i fattori che contribuiscono includono una popolazione ridotta di cellule beta delle isole, una funzione secretoria compromessa delle cellule beta sopravvissute e la resistenza all’insulina dei tessuti periferici. Il diabete di tipo 2 è inoltre caratterizzato da un’aumentata secrezione di glucagone, che rimane insensibile e non risponde alle concentrazioni di glucosio nel sangue. Tuttavia, l’insulina continua ad essere secreta nel sangue in risposta al glucosio nel sangue. Di conseguenza, il glucosio si accumula nel flusso sanguigno.

La proteina umana dell'insulina comprende 51 aminoacidi e possiede una massa molecolare di 5808 Da. Esiste come un eterodimero, costituito da una catena A e una catena B, che sono legate covalentemente da legami disolfuro. La configurazione strutturale dell’insulina mostra piccole variazioni tra le diverse specie animali. A causa di queste differenze tra le specie, l’insulina derivata da fonti animali non umane dimostra un’efficacia alquanto varia nel metabolismo dei carboidrati rispetto all’insulina umana. L'insulina suina, essendo particolarmente simile alla sua controparte umana, è stata ampiamente utilizzata per il trattamento di individui con diabete di tipo 1 prima della produzione su larga scala di insulina umana tramite tecnologie del DNA ricombinante.

L'insulina detiene la particolarità di essere l'ormone peptidico inaugurale identificato. Nel 1921, Frederick Banting e Charles Best, conducendo ricerche nel laboratorio di John Macleod presso l'Università di Toronto, isolarono con successo l'insulina dal tessuto pancreatico canino. Frederick Sanger ne delucida successivamente la sequenza completa di aminoacidi nel 1951, contrassegnando l'insulina come la prima proteina ad essere completamente sequenziata. Dorothy Hodgkin determinò la struttura cristallina dell'insulina allo stato solido nel 1969. Inoltre, l'insulina fu la prima proteina ad essere sintetizzata chimicamente e prodotta utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante. È incluso nell'elenco modello dei farmaci essenziali dell'OMS, a significare la sua importanza come farmaco fondamentale all'interno dei sistemi sanitari di base.

Traiettoria evolutiva e distribuzione interspecie

Le origini molecolari dell'insulina si estendono probabilmente per oltre un miliardo di anni e risalgono ai primi eucarioti unicellulari. Al di fuori del regno animale, proteine ​​simili all'insulina sono state identificate nei funghi e nei protisti.

Nella maggior parte dei vertebrati, l'insulina viene sintetizzata dalle cellule beta all'interno delle isole pancreatiche, mentre alcuni pesci teleostei la producono nel corpo di Brockmann. In particolare, le lumache di mare velenose, in particolare Conus geographus e Conus tulipa, utilizzano forme di insulina modificate nei loro cocktail di veleno per inabilitare i piccoli pesci. Questa tossina insulinica, strutturalmente più simile all'insulina dei pesci che all'insulina endogena delle lumache, riduce i livelli di glucosio nel sangue delle prede, rallentandole.

Produzione

Nei mammiferi, l'insulina è generata esclusivamente dalle cellule beta delle isole pancreatiche, mentre in alcuni pesci ha origine dal corpo di Brockmann. La sintesi dell'insulina umana è diretta dal gene INS, situato sul cromosoma 11. I roditori possiedono due geni funzionali dell'insulina: uno è un omologo della maggior parte dei geni dei mammiferi (Ins2), e l'altro è una copia retroposta, contenente una sequenza promotrice ma priva di un introne (Ins1). La trascrizione del gene dell'insulina aumenta in risposta a livelli elevati di glucosio nel sangue, un processo regolato principalmente da fattori di trascrizione che si legano a sequenze potenziatrici a circa 400 paia di basi a monte del sito di inizio della trascrizione del gene.

I fattori chiave di trascrizione che regolano la secrezione di insulina includono PDX1, NeuroD1 e MafA.

In condizioni di basso livello di glucosio, risiede PDX1 (proteina homeobox pancreatica e duodenale 1) nella periferia nucleare a causa della sua interazione con HDAC1 e HDAC2, portando ad una sottoregolazione della secrezione di insulina. Al contrario, elevati livelli di glucosio nel sangue inducono la fosforilazione di PDX1, provocandone la traslocazione nucleare e il successivo legame con l’elemento A3 all’interno del promotore dell’insulina. Dopo la traslocazione, PDX1 si impegna con i coattivatori HAT p300 e SETD7. PDX1 influenza le modificazioni degli istoni attraverso l'acetilazione, la deacetilazione e la metilazione e si dice anche che sopprima il glucagone.

NeuroD1, identificato anche come β2, governa l'esocitosi dell'insulina nelle cellule β pancreatiche stimolando direttamente l'espressione di geni cruciali per questo processo. Sebbene sia tipicamente citosolica, la β2 subisce glicosilazione da parte di OGT e/o fosforilazione da parte di ERK in risposta ad alti livelli di glucosio, innescando la sua traslocazione nucleare. All'interno del nucleo, β2 eterodimerizza con E47, si lega all'elemento E1 del promotore dell'insulina e recluta il coattivatore p300, che acetila β2. Inoltre, la β2 può interagire con altri fattori di trascrizione per attivare il gene dell'insulina.

MafA subisce una degradazione proteasomale quando i livelli di glucosio nel sangue sono bassi. Elevate concentrazioni di glucosio portano alla glicosilazione di una proteina non identificata, che quindi funziona come fattore di trascrizione per MafA attraverso un meccanismo sconosciuto, provocando il trasporto di MafA fuori dalla cellula. Successivamente, MafA trasloca nuovamente nel nucleo, dove si lega all'elemento C1 del promotore dell'insulina.

Questi fattori di trascrizione operano sinergicamente all'interno di un'intricata rete di regolamentazione. L’iperglicemia prolungata può compromettere la capacità di legame di queste proteine, diminuendo di conseguenza la secrezione di insulina e contribuendo allo sviluppo del diabete. Questa riduzione dell’attività legante può essere mediata dallo stress ossidativo indotto dal glucosio e si ritiene che gli antiossidanti mitigano la ridotta secrezione di insulina nelle cellule β pancreatiche glucotossiche. Inoltre, le molecole di segnalazione dello stress e le specie reattive dell'ossigeno inibiscono il gene dell'insulina interferendo sia con i fattori di trascrizione stessi che con i loro cofattori leganti.

La regione promotrice del gene dell'insulina umana contiene diverse sequenze regolatrici che si legano a specifici fattori di trascrizione. Generalmente, le A-box interagiscono con i fattori Pdx1, le E-box con NeuroD, le C-box con MafA e gli elementi di risposta cAMP con CREB. Inoltre, sono presenti elementi silenziatori che inibiscono la trascrizione.

Sintesi

L'insulina viene sintetizzata inizialmente come preproinsulina, una proteina precursore inattiva comprendente 110 aminoacidi. Questa preproinsulina subisce una traduzione diretta all'interno del reticolo endoplasmatico ruvido (RER), dove la peptidasi segnale successivamente asporta il suo peptide segnale, producendo proinsulina. Durante il processo di ripiegamento della proinsulina, i suoi terminali opposti, designati come "catena A" e "catena B", vengono legati covalentemente da tre legami disolfuro. Successivamente, la proinsulina ripiegata attraversa l'apparato del Golgi e viene incapsulata all'interno di vescicole secretorie specializzate, note anche come granuli. All'interno di questi granuli, la proinsulina subisce la scissione proteolitica da parte della proproteina convertasi 1/3 e della proproteina convertasi 2, che asporta il segmento centrale della proteina, chiamato "peptide C". In definitiva, la carbossipeptidasi E facilita la rimozione di due coppie di aminoacidi dalle estremità della proteina, culminando nella formazione di insulina attiva, caratterizzata dalle sue catene A e B ora interconnesse da due legami disolfuro.

L'insulina matura così formata viene immagazzinata all'interno di granuli maturi, in attesa di specifici stimoli metabolici (ad esempio leucina, arginina, glucosio e mannosio) e dell'attivazione del nervo vago per innescare la sua esocitosi. dalla cellula nella circolazione sistemica.

La ricerca indica che l'insulina e le proteine associate sono sintetizzate all'interno del cervello e le concentrazioni ridotte di queste proteine sono correlate con il morbo di Alzheimer.

La secrezione di insulina è ulteriormente stimolata dall'attivazione del recettore beta-2 e soppressa dall'attivazione del recettore alfa-1. Inoltre, durante i periodi di stress fisiologico, il cortisolo, il glucagone e l'ormone della crescita esercitano effetti antagonisti sull'azione dell'insulina. Inoltre, l'insulina sopprime il rilascio di acidi grassi mediato dalla lipasi ormono-sensibile all'interno del tessuto adiposo.

Struttura

Inizialmente si presumeva che gli ormoni fossero entità chimiche relativamente piccole; tuttavia, l'insulina, in quanto primo ormone peptidico di cui è stata chiarita la struttura, si è rivelata notevolmente più grande. Un'unità monomerica di insulina umana comprende 51 aminoacidi e possiede una massa molecolare di 5808 Da. La sua formula molecolare è C₂₅₇H₃₈₃N₆₅O₇₇S§8_{9§. Strutturalmente, è un dimero composto da due catene peptidiche, denominate catena A e catena B, che sono interconnesse da due legami disolfuro. La catena A contiene 21 aminoacidi, mentre la catena B comprende 30 residui. Questi legami disolfuro intercatena vengono stabiliti tra i residui di cisteina nelle posizioni A7-B7 e A20-B19. All'interno della catena A esiste un ulteriore legame disolfuro intracatena, che collega i residui di cisteina nelle posizioni A6 e A11. La catena A mostra due regioni α-elicoidali antiparallele che si estendono su A1-A8 e A12-A19. Al contrario, la catena B presenta un'α-elica centrale (che comprende i residui B9-B19), fiancheggiata dai legami disolfuro, e due fogli β (che ricoprono B7-B10 e B20-B23).}

La sequenza aminoacidica dell'insulina dimostra una notevole conservazione, mostrando solo piccole variazioni tra le diverse specie. Ad esempio, l’insulina bovina differisce dall’insulina umana solo per tre residui aminoacidici, mentre l’insulina suina differisce solo per uno. In particolare, l’insulina derivata da alcune specie di pesci possiede una somiglianza strutturale sufficiente con l’insulina umana per ottenere efficacia clinica nei soggetti umani. Inoltre, l’insulina trovata in alcuni invertebrati mostra una notevole somiglianza di sequenza con l’insulina umana e suscita risposte fisiologiche comparabili. Questa pronunciata omologia tra le sequenze di insulina di diverse specie indica la sua significativa conservazione evolutiva attraverso la filogenesi animale. Al contrario, il peptide C della proinsulina mostra una variabilità interspecie considerevolmente maggiore; sebbene funzioni anche come ormone, il suo ruolo è considerato secondario.

All'interno del corpo, l'insulina viene sintetizzata e immagazzinata come esamero, comprendente sei molecole di insulina, sebbene la sua forma biologicamente attiva sia il monomero. Questo complesso esamerico ha una massa molecolare approssimativa di 36000 Da. Le sei molecole costituenti sono disposte in tre unità dimeriche, formando una struttura simmetrica. Una caratteristica strutturale critica è la presenza di atomi di zinco (Zn²⁺) situati lungo l'asse di simmetria, ciascuno coordinato da tre molecole d'acqua e tre residui di istidina in posizione B10.

L'insulina esamero rappresenta una forma inattiva e stabile che salvaguarda l'insulina altamente reattiva mantenendone la disponibilità. La trasformazione tra esamero e monomero è una considerazione critica nello sviluppo di formulazioni di insulina per iniezione. Mentre l’esamero mostra una stabilità superiore, il che è vantaggioso per le applicazioni pratiche, il monomero agisce come un agente terapeutico ad azione significativamente più rapida grazie alla relazione inversa tra velocità di diffusione e dimensione delle particelle. La rapida azione del monomero consente di somministrare iniezioni di insulina più vicino all’ora dei pasti, migliorando così la flessibilità di programmazione per le persone con diabete. Inoltre, l'insulina è suscettibile all'aggregazione, formando fogli beta fibrillare interdigitati, che possono portare all'amiloidosi da iniezione e impedire la conservazione a lungo termine.

Funzione

Secrezione

Le cellule beta all'interno delle isole di Langerhans secernono insulina attraverso un processo bifasico. La fase iniziale di rilascio viene avviata rapidamente da elevate concentrazioni di glucosio nel sangue e tipicamente persiste per circa 10 minuti. La seconda fase successiva prevede un rilascio graduale e prolungato delle vescicole appena sintetizzate, che viene attivato indipendentemente dai livelli di glucosio e raggiunge il suo picco entro 2-3 ore. L'esistenza di queste due fasi distinte della secrezione di insulina implica la presenza di diverse popolazioni o "pool" di granuli di insulina. Durante la prima fase dell'esocitosi dell'insulina, la maggior parte dei granuli pronti per il rilascio vengono scaricati in seguito all'internalizzazione del calcio. Questa specifica raccolta di granuli è denominata Readily Releasable Pool (RRP). I granuli RRP costituiscono lo 0,3-0,7% della popolazione totale di granuli contenenti insulina e sono situati in prossimità della membrana plasmatica. Al contrario, la seconda fase dell'esocitosi richiede la mobilitazione dei granuli sulla membrana plasmatica e la loro preventiva preparazione per il rilascio. Di conseguenza, la velocità della seconda fase della secrezione di insulina è dettata dalla velocità con cui questi granuli sono pronti per essere scaricati. Questo pool è denominato Reserve Pool (RP). L'RP mostra una velocità di rilascio più lenta rispetto all'RRP, con velocità osservate di 18 granuli/min per RRP e 6 granuli/min per RP. Un ridotto rilascio di insulina nella prima fase può rappresentare la prima disfunzione identificabile delle cellule beta indicativa dell’insorgenza del diabete di tipo 2. Sia il rilascio della prima fase che la sensibilità all'insulina funzionano come indicatori prognostici indipendenti per il diabete.

La fase iniziale del rilascio di insulina è caratterizzata dalla seguente sequenza di eventi:

• Il glucosio permea le cellule β attraverso i trasportatori del glucosio, in particolare GLUT 2. Quando i livelli di glucosio nel sangue sono bassi, una minima quantità di glucosio entra nelle cellule β; al contrario, elevate concentrazioni di glucosio nel sangue facilitano l'ingresso di notevoli quantità di glucosio in queste cellule.
• Quando entra nella cellula β, il glucosio subisce la fosforilazione in glucosio-6-fosfato (G-6-P) catalizzata dalla glucochinasi (esochinasi IV). A differenza delle esochinasi I-III presenti in altri tessuti, la glucochinasi non è soggetta all'inibizione del prodotto da parte del G-6-P. Questa caratteristica garantisce che la concentrazione intracellulare di G-6-P sia direttamente correlata alla concentrazione prevalente di glucosio nel sangue.
• Il glucosio-6-fosfato entra successivamente nella via glicolitica e quindi, attraverso la reazione della piruvato deidrogenasi, procede nel ciclo di Krebs. All'interno del ciclo di Krebs, l'ossidazione dell'acetil CoA, che funge da substrato del ciclo, genera numerose molecole di ATP ad alta energia, aumentando di conseguenza il rapporto intracellulare ATP:ADP.
• Un elevato rapporto intracellulare ATP:ADP induce la chiusura del canale del potassio SUR1/Kir6.2 sensibile all'ATP. Questa azione impedisce l'efflusso degli ioni potassio (K⁺) dalla cellula tramite diffusione facilitata, con conseguente accumulo di ioni potassio intracellulari. Di conseguenza, l'ambiente cellulare interno diventa meno carico negativamente rispetto all'esterno, culminando nella depolarizzazione della membrana della superficie cellulare.
• Dopo la depolarizzazione, si attivano i canali degli ioni calcio voltaggio-dipendenti (Ca²⁺), consentendo l'afflusso di ioni calcio nella cellula attraverso una diffusione facilitata.
• La concentrazione di ioni calcio citosolici può anche essere aumentata dal rilascio di calcio dai depositi intracellulari, un processo mediato dall'attivazione dei recettori della rianodina.
• La concentrazione di ioni calcio nel citosol delle cellule beta può anche essere elevata attraverso l'attivazione della fosfolipasi C, innescata dal legame di un ligando extracellulare (ad esempio, un ormone o un neurotrasmettitore) a un recettore di membrana accoppiato a proteine G. Questo enzima scinde il fosfolipide di membrana fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato in inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerolo. Successivamente, IP3 si lega alle proteine ​​​​recettrici situate sulla membrana del reticolo endoplasmatico (ER). Questo legame facilita il rilascio di ioni Ca²⁺ dal ER attraverso i canali controllati da IP3, aumentando così la concentrazione di calcio citosolico indipendentemente dagli elevati livelli di glucosio nel sangue. La stimolazione parasimpatica delle isole pancreatiche utilizza questo percorso per aumentare la secrezione di insulina nel flusso sanguigno.
• Questo sostanziale aumento della concentrazione di ioni calcio citosolici innesca l'esocitosi dell'insulina pre-sintetizzata, che viene immagazzinata all'interno di vescicole secretorie intracellulari, nel flusso sanguigno.

Questa via rappresenta il meccanismo principale per la secrezione di insulina. Ulteriori sostanze riconosciute per stimolare il rilascio di insulina comprendono gli aminoacidi arginina e leucina, l'acetilcolina rilasciata attraverso la stimolazione parasimpatica (che opera attraverso la via della fosfolipasi C), la sulfonilurea, la colecistochinina (CCK), che agisce anche attraverso la fosfolipasi C, e le incretine di derivazione gastrointestinale, tra cui il peptide-1 simil-glucagone (GLP-1) e il peptide insulinotropico glucosio-dipendente. (GIP).

La secrezione di insulina viene significativamente soppressa dalla norepinefrina (noradrenalina), contribuendo ad elevate concentrazioni di glucosio nel sangue durante i periodi di stress. Il rilascio di catecolamine dal sistema nervoso simpatico esercita effetti contraddittori sulla secrezione di insulina delle cellule beta, poiché è inibito dai recettori α₂-adrenergici ma stimolato dai recettori β₂-adrenergici. Di conseguenza, l'impatto complessivo della norepinefrina proveniente dall'innervazione simpatica e dell'epinefrina proveniente dalle ghiandole surrenali sul rilascio di insulina è inibitorio, principalmente a causa della predominanza dell'attivazione dei recettori α-adrenergici.

Quando i livelli di glucosio nel sangue ritornano al loro livello fisiologico di base, la secrezione di insulina dalle cellule β rallenta o cessa. Se le concentrazioni di glucosio nel sangue scendono al di sotto di questa soglia, in particolare a livelli criticamente bassi, gli ormoni iperglicemici (prevalentemente glucagone dalle cellule alfa delle isole pancreatiche) inducono il rilascio di glucosio nel flusso sanguigno dalle riserve di glicogeno epatico, con la gluconeogenesi che integra questo processo se le riserve di glicogeno sono esaurite. Attraverso l'aumento del glucosio nel sangue, questi ormoni iperglicemici prevengono o correggono efficacemente l'ipoglicemia potenzialmente pericolosa per la vita.

Un rilascio alterato di insulina nella prima fase è osservabile durante un test di tolleranza al glucosio, caratterizzato da un livello di glucosio nel sangue significativamente elevato 30 minuti dopo l'ingestione di un carico di glucosio (75 o 100 g), seguito da un calo graduale nei successivi 100 minuti, rimanendo comunque al di sopra di 120 mg/100 ml due ore dopo l'inizio del test. Al contrario, negli individui sani, i livelli di glucosio nel sangue vengono normalizzati (e possono anche presentare una leggera sovracorrezione) alla conclusione del test. Un picco iniziale di insulina rappresenta una "prima risposta" all'aumento della glicemia; questa risposta è individuale e dose-specifica, nonostante le ipotesi precedenti secondo cui fosse esclusivamente specifica per il tipo di alimento.

Oscillazioni

Durante la digestione, in genere una o due ore dopo il pasto, la secrezione pancreatica di insulina non è continua ma oscilla con una periodicità di 3-6 minuti, fluttuando tra concentrazioni di insulina nel sangue che superano circa 800 pmol/L e scendono al di sotto di 100 pmol/L (come osservato nei ratti). Si ipotizza che questo modello oscillatorio prevenga la downregulation dei recettori dell’insulina nelle cellule bersaglio e faciliti l’estrazione epatica dell’insulina dal flusso sanguigno. Di conseguenza, questa secrezione pulsatile è una considerazione cruciale per la somministrazione di farmaci stimolanti l’insulina, poiché una concentrazione di insulina nel sangue oscillante, piuttosto che un livello elevato e costante, è l’obiettivo terapeutico ideale. Tale somministrazione ritmica può essere ottenuta attraverso la somministrazione pulsatile di insulina nella vena porta, sistemi di somministrazione attivati dalla luce o il trapianto di cellule insulari nel fegato.

Livello di insulina nel sangue

Le concentrazioni di insulina nel sangue possono essere quantificate utilizzando unità internazionali (ad esempio, μIU/mL) o concentrazioni molari (ad esempio, pmol/L), con 1 μIU/mL equivalente a 6,945 pmol/L. I livelli di insulina nel sangue tra i pasti variano generalmente da 8 a 11 μIU/mL (57-79 pmol/L).

Trasduzione del segnale

Gli effetti fisiologici dell'insulina iniziano con il suo legame con il recettore dell'insulina (IR), una proteina integrale di membrana situata sulla superficie cellulare. Questo recettore comprende sia subunità alfa (α) che beta (β), che tipicamente si associano per formare un omodimero. L'insulina si lega specificamente alle subunità α extracellulari di questo complesso omodimerico, attivando l'attività intrinseca della tirosina chinasi delle subunità β. Questa attivazione porta all'autofosforilazione delle subunità β, seguita dalla fosforilazione delle proteine ​​intracellulari chiamate substrati del recettore dell'insulina (IRS). La fosforilazione delle proteine ​​IRS avvia una complessa cascata di trasduzione del segnale, culminante nell'attivazione di varie chinasi e fattori di trascrizione che orchestrano le azioni intracellulari dell'insulina.

Una cascata di segnalazione chiave, avviata dall'attivazione IRS-1 della fosfoinositolo 3-chinasi (PI3K), media diversi processi metabolici critici. Questi includono la traslocazione dei trasportatori del glucosio GLUT4 nelle membrane cellulari delle cellule muscolari e adipose, la sintesi del glicogeno nei tessuti epatici e muscolari e la conversione del glucosio in trigliceridi nel fegato, nel tessuto adiposo e nelle ghiandole mammarie in allattamento. PI3K catalizza la fosforilazione del fosfolipide di membrana fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP2) in fosfatidilinositolo 3,4,5-trifosfato (PIP3), che successivamente attiva la proteina chinasi B (PKB). La PKB attivata promuove la fusione degli endosomi contenenti GLUT4 con la membrana plasmatica, aumentando così la densità dei trasportatori GLUT4 sulla superficie cellulare. Inoltre, PKB fosforila e inattiva la glicogeno sintasi chinasi (GSK). Di conseguenza, il suo substrato, la glicogeno sintasi (GS), rimane defosforilato e quindi attivo. La glicogeno sintasi attiva (GS) è fondamentale per la fase di limitazione della velocità nella sintesi del glicogeno dal glucosio. Analoghi eventi di defosforilazione influenzano gli enzimi che regolano la glicolisi, che porta alla sintesi dei grassi tramite malonil-CoA nei tessuti produttori di trigliceridi, e anche gli enzimi che governano la gluconeogenesi epatica. Il risultato cumulativo di queste defosforilazioni enzimatiche è la stimolazione della sintesi di glicogeno e grasso dal glucosio nei tessuti interessati, insieme all’inibizione della produzione epatica di glucosio attraverso la glicogenolisi e la gluconeogenesi. Inoltre, la lipolisi dei trigliceridi in acidi grassi liberi e glicerolo nel tessuto adiposo viene soppressa.

Dopo la generazione di segnali intracellulari avviati dal legame del recettore dell'insulina, i meccanismi di terminazione del segnale diventano essenziali. Un meccanismo primario per la terminazione del segnale coinvolge l'endocitosi e la successiva degradazione del complesso recettore dell'insulina. Inoltre, la via di segnalazione è attenuata dalla defosforilazione dei residui di tirosina all'interno di vari componenti di segnalazione, mediata dalle tirosin fosfatasi. Le serina/treonina chinasi sono riconosciute anche per il loro ruolo nel ridurre l'attività dell'insulina.

La delucidazione strutturale del complesso recettore insulina-insulina è stata ottenuta mediante cristallografia a raggi X.

Effetti fisiologici

Le azioni dell'insulina sul metabolismo umano globale includono:

• Miglioramento dell'assorbimento cellulare di sostanze specifiche, in particolare del glucosio nei tessuti muscolari e adiposi, che costituiscono circa i due terzi delle cellule del corpo.
• Promozione della replicazione del DNA e della sintesi proteica, mediata dalla regolazione dell'assorbimento degli aminoacidi.
• Modifica dell'attività di numerosi enzimi.

Le azioni cellulari dell'insulina (sia indirette che dirette) comprendono:

• Stimola l'assorbimento del glucosio: l'insulina riduce i livelli di glucosio nel sangue promuovendo l'assorbimento del glucosio a livello cellulare. Questo effetto si ottiene principalmente attraverso l'induzione da parte dell'insulina dell'inserimento del trasportatore GLUT4 nelle membrane cellulari dei tessuti muscolari e adiposi, facilitando così l'ingresso del glucosio in queste cellule.
• Sintesi migliorata dei grassi: l'insulina costringe gli adipociti ad assorbire il glucosio nel sangue, che viene successivamente convertito in trigliceridi; una riduzione dei livelli di insulina provoca l'effetto opposto.
• Elevata esterificazione degli acidi grassi: l'insulina stimola il tessuto adiposo a sintetizzare i grassi neutri (trigliceridi) dagli acidi grassi; al contrario, livelli ridotti di insulina invertono questo processo.
• Lipolisi ridotta: l'insulina inibisce la conversione delle riserve lipidiche degli adipociti in acidi grassi liberi circolanti e glicerolo; una diminuzione dei livelli di insulina favorisce la reazione inversa.
• Concentrazioni elevate di glucosio stimolano l'insulina a indurre la formazione di glicogeno attraverso l'attivazione dell'esochinasi, un enzima che fosforila il glucosio, intrappolandolo all'interno della cellula. Allo stesso tempo, l’insulina inibisce la glucosio-6-fosfatasi, che tipicamente rimuove questo gruppo fosfato. Entrambi gli enzimi sono cruciali per la sintesi del glicogeno, un processo ulteriormente supportato dall'attivazione della fosfofruttochinasi e della glicogeno sintasi da parte dell'insulina.
• L'insulina riduce significativamente la gluconeogenesi e la glicogenolisi, diminuendo così la produzione epatica di glucosio da precursori non carboidrati; la maggior parte dell'insulina endogena che raggiunge il fegato rimane all'interno di questo organo. Al contrario, livelli insufficienti di insulina portano ad un aumento della produzione epatica di glucosio da vari substrati.
• L'insulina diminuisce la proteolisi, ovvero la degradazione delle proteine.
• L'autofagia, la degradazione degli organelli danneggiati, viene ridotta dall'insulina, con i livelli di insulina postprandiali che inibiscono completamente questo processo.
• L'insulina favorisce l'assorbimento cellulare degli aminoacidi circolanti; una riduzione dei livelli di insulina di conseguenza inibisce questo assorbimento.
• L'insulina induce il rilassamento dei muscoli della parete arteriosa, in particolare delle microarterie, portando ad un aumento del flusso sanguigno; una carenza di insulina provoca la contrazione di questi muscoli, riducendo così il flusso.
• L'insulina aumenta la secrezione di acido cloridrico da parte delle cellule parietali gastriche.
• L'insulina stimola l'assorbimento di potassio da parte delle cellule che sintetizzano il glicogeno, una sostanza altamente idratata che aumenta il contenuto di acqua intracellulare e gli ioni K⁺ associati, dai fluidi extracellulari; una mancanza di insulina impedisce questo assorbimento. Questo aumento dell'assorbimento cellulare di potassio da parte dell'insulina riduce di conseguenza le concentrazioni di potassio nel plasma sanguigno, potenzialmente attraverso la traslocazione mediata dall'insulina della Na⁺/K⁺-ATPasi sulla superficie delle cellule muscolari scheletriche.
• L'insulina riduce l'escrezione renale di sodio.
• Negli epatociti, il legame acuto all'insulina attiva la proteina fosfatasi 2A (PP2A), che defosforila l'enzima bifunzionale fruttosio bisfosfatasi-2 (PFKB1), attivando così il sito attivo della fosfofruttochinasi-2 (PFK-2). PFK-2 aumenta successivamente la produzione di fruttosio 2,6-bifosfato, che attiva allostericamente PFK-1, favorendo la glicolisi rispetto alla gluconeogenesi. Una glicolisi potenziata porta ad un aumento della formazione di malonil-CoA, una molecola che può essere diretta verso la lipogenesi e inibisce allostericamente la carnitina palmitoiltransferasi I (CPT1), un enzima mitocondriale essenziale per la traslocazione degli acidi grassi nello spazio intermembrana mitocondriale per il metabolismo.

L'insulina esercita anche un'influenza su varie altre funzioni fisiologiche, tra cui la compliance vascolare e i processi cognitivi. Entrando nel cervello umano, l'insulina migliora l'apprendimento e la memoria, con particolare beneficio per la memoria verbale. Inoltre, il miglioramento della segnalazione dell’insulina cerebrale tramite la somministrazione intranasale di insulina aumenta le risposte acute termoregolatorie e glucoregolatorie all’assunzione di cibo, suggerendo che l’insulina del sistema nervoso centrale coordina un ampio spettro di processi omeostatici e regolatori. L'insulina stimola inoltre il rilascio dell'ormone di rilascio delle gonadotropine dall'ipotalamo, promuovendo così la fertilità.

Classificazione anabolica e reponica

Storicamente, l'insulina è stata ampiamente classificata come un ormone anabolico a causa del suo ruolo nello stimolare la sintesi di molecole complesse. Tuttavia, la letteratura medica contemporanea propone di riclassificare l'insulina specificamente come ormone reponico (derivato dal latino repono, che significa "immagazzinare") per differenziare più accuratamente la sua funzione metabolica da quella dei classici ormoni anabolizzanti come il testosterone o l'ormone della crescita. Mentre i classici ormoni anabolizzanti guidano processi ad alta intensità energetica per costruire tessuto magro metabolicamente attivo, il ruolo fisiologico primario di un ormone reponico è quello di conservare e immagazzinare energia sistemica. L’insulina raggiunge questo obiettivo facilitando l’assorbimento cellulare del glucosio e dei lipidi per la conservazione (lipogenesi e glicogenesi) e contemporaneamente inibendo la degradazione dell’energia immagazzinata (lipolisi e glicogenolisi). I ricercatori sostengono che questa distinzione offre un quadro più chiaro per comprendere il motivo per cui l'iperinsulinemia è caratterizzata unicamente da adiposità centrale e sindrome metabolica, piuttosto che dalla crescita di tessuto magro.

Degrado

Dopo che una molecola di insulina si lega al suo recettore ed esercita il suo effetto fisiologico, può essere rilasciata nuovamente nello spazio extracellulare o subire una degradazione cellulare. Il fegato e i reni costituiscono gli organi primari responsabili della clearance dell’insulina. L'insulina viene catabolizzata dalla proteina-disolfuro reduttasi (glutatione), un enzima che scinde i legami disolfuro che collegano le catene A e B. Il fegato elimina principalmente l’insulina durante il suo passaggio iniziale, mentre i reni sono responsabili dell’eliminazione della maggior parte dell’insulina circolante a livello sistemico. Tipicamente, la degradazione comporta l'endocitosi del complesso del recettore dell'insulina, successivamente seguita dall'azione dell'enzima di degradazione dell'insulina. Si stima che l'insulina prodotta per via endogena dalle cellule beta venga degradata circa un'ora dopo il suo rilascio iniziale in circolazione, con un'emivita osservata di circa 4-6 minuti.

Regolatore del metabolismo degli endocannabinoidi

L'insulina funziona come un importante regolatore del metabolismo degli endocannabinoidi (EC); È stato dimostrato che la somministrazione di insulina terapeutica riduce i livelli intracellulari di EC, in particolare 2-arachidonoilglicerolo (2-AG) e anandamide (AEA). Queste riduzioni sono correlate ad alterazioni insulino-sensibili nell'espressione degli enzimi coinvolti nel metabolismo EC. All’interno degli adipociti insulino-resistenti, i modelli tipici dell’espressione enzimatica indotta dall’insulina vengono interrotti, portando ad un aumento della sintesi di EC e ad una diminuzione della degradazione dell’EC. La ricerca indica che gli adipociti insulino-resistenti non sono in grado di regolare adeguatamente il metabolismo della CE e di ridurre i livelli di CE intracellulare in seguito alla stimolazione dell’insulina, con conseguente concentrazione elevata di CE negli individui obesi e insulino-resistenti. Questa disregolazione metabolica contribuisce all'eccessivo accumulo di grasso viscerale, alla diminuzione della secrezione di adiponectina dal tessuto adiposo addominale e al conseguente sviluppo di vari fattori di rischio cardiometabolico associati all'obesità e al diabete di tipo 2.

Ipoglicemia

L'ipoglicemia, comunemente definita "basso livello di zucchero nel sangue", si verifica quando i livelli di glucosio nel sangue scendono al di sotto del range fisiologico normale. Questa condizione può manifestarsi con diversi sintomi, come difficoltà di coordinazione, difficoltà di linguaggio, disorientamento, perdita di coscienza, convulsioni o addirittura mortalità. Ulteriori manifestazioni possono includere sensazioni di fame, diaforesi, tremori e astenia. L'insorgenza di questi sintomi è tipicamente rapida.

L'eziologia predominante dell'ipoglicemia coinvolge gli agenti farmacologici impiegati nella gestione del diabete, in particolare l'insulina e le sulfaniluree. Il rischio è elevato nei soggetti diabetici che hanno ridotto l’assunzione di cibo tipico, aumentato l’attività fisica o consumato alcol. Altri fattori che contribuiscono all’ipoglicemia comprendono l’insufficienza renale, condizioni neoplastiche specifiche come l’insulinoma, la disfunzione epatica, l’ipotiroidismo, il digiuno prolungato, i disordini metabolici ereditari, le infezioni gravi, l’ipoglicemia reattiva e vari agenti farmaceutici, compreso l’etanolo. Inoltre, i neonati normoglicemici possono manifestare un basso livello di zucchero nel sangue se non vengono nutriti per diverse ore.

Malattie e sindromi

I disturbi patologici nella funzione dell'insulina sono associati a diverse condizioni mediche:

• Diabete è una definizione ampia che comprende tutti gli stati fisiologici caratterizzati da iperglicemia. Questa condizione si manifesta in varie forme, tra cui:
  • Diabete di tipo 1, che comporta la distruzione mediata da autoimmune delle cellule β pancreatiche produttrici di insulina, portando a una carenza assoluta di insulina.
  • Il diabete di tipo 2 è caratterizzato da un'insufficiente produzione di insulina da parte delle cellule β, da resistenza all'insulina o da una combinazione di entrambi, derivante da eziologie non ancora completamente chiarite.
    • Sono state osservate correlazioni con modelli alimentari, stili di vita sedentari, obesità, età avanzata e sindrome metabolica. Relazioni causali sono state stabilite in vari organismi modello, come topi e scimmie. In particolare, il diabete di tipo 2 può colpire anche individui non obesi a causa di fattori dietetici, abitudini sedentarie e fattori di rischio non identificati, sebbene il nesso causale preciso in questi casi possa richiedere ulteriori indagini.
    • Si ipotizza che una predisposizione genetica contribuisca allo sviluppo del diabete di tipo 2 quando gli individui sono esposti a condizioni ambientali specifiche.
  • Altri tipi di ridotta tolleranza al glucosio.
• L'insulinoma è un tumore che origina dalle cellule beta del pancreas, che provoca un'eccessiva produzione di insulina o un'ipoglicemia reattiva.
• La sindrome metabolica, inizialmente chiamata "sindrome X" da Gerald Reaven, rappresenta una condizione che rimane non completamente compresa. La sua eziologia è ambigua, con un dibattito in corso sul fatto che derivi da una causa singolare e trattabile o sia la conseguenza di alterazioni fisiologiche che predispongono gli individui al diabete di tipo 2. I criteri diagnostici chiave includono pressione sanguigna elevata, dislipidemia (definita come anomalie nelle frazioni di colesterolo nel sangue e in altri lipidi circolanti) e un aumento della circonferenza della vita, particolarmente osservato nelle popolazioni dei paesi sviluppati. Un meccanismo fondamentale sottostante è potenzialmente la resistenza all’insulina, precursore del diabete di tipo 2, caratterizzata da una ridotta risposta all’insulina in tessuti specifici, come il muscolo e il tessuto adiposo. Si osserva frequentemente lo sviluppo di comorbilità associate, tra cui ipertensione essenziale, obesità, diabete di tipo 2 e malattie cardiovascolari (CVD).
• La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è una condizione multiforme che colpisce le donne durante l'età riproduttiva e si manifesta tipicamente con anovulazione ed eccesso di androgeni, spesso evidenti come irsutismo. La resistenza all'insulina è una caratteristica prevalente in numerosi casi di PCOS.

Applicazioni mediche

L'insulina umana biosintetica (insulina umana rDNA, INN) destinata all'applicazione clinica è prodotta mediante la tecnologia del DNA ricombinante. Questa forma biosintetica mostra una purezza superiore rispetto all'insulina estratta da fonti animali, e la sua maggiore purezza contribuisce a ridurre la formazione di anticorpi. Inoltre, i ricercatori sono riusciti a integrare con successo il gene dell’insulina umana nelle piante, in particolare nel cartamo, stabilendo un metodo di produzione alternativo chiamato “biopharming”. Si prevede che questa tecnica innovativa ridurrà i costi di produzione.

Al momento sono accessibili numerosi analoghi dell'insulina umana. Questi analoghi, strutturalmente simili all’insulina umana, sono stati progettati per soddisfare requisiti specifici per la gestione glicemica, offrendo profili sia ad azione rapida (prandiale) che a lunga azione (basale). Humalog (insulina lispro) è stato il primo analogo biosintetico dell'insulina sviluppato per l'applicazione clinica come insulina pasto (prandiale), dimostrando un assorbimento sottocutaneo più rapido e un inizio di azione entro 15 minuti dopo l'iniezione rispetto all'insulina regolare. Altri analoghi ad azione rapida, come NovoRapid e Apidra, mostrano profili farmacocinetici comparabili. Il loro rapido assorbimento è attribuito a specifiche sequenze di aminoacidi che inibiscono la formazione di dimeri ed esameri, poiché le forme monomeriche di insulina vengono assorbite più rapidamente. A differenza delle insuline umane e animali, le formulazioni ad azione rapida eliminano la necessità di un intervallo di iniezione prima del pasto. La seconda categoria comprende le insuline ad azione prolungata, di cui Lantus (insulina glargine) è stata la prima introdotta. Questi forniscono un effetto terapeutico costante per una durata prolungata, tipicamente da 18 a 24 ore. Allo stesso modo, Levemir, un altro analogo dell’insulina protratta, utilizza una strategia di acilazione degli acidi grassi. L'attaccamento di una molecola di acido miristico a questo analogo facilita la sua associazione con abbondante albumina sierica, prolungandone così l'azione e mitigando il rischio di ipoglicemia. Entrambi gli analoghi protratti vengono somministrati una volta al giorno e servono come insulina basale per i soggetti con diabete di tipo 1. Inoltre, sono disponibili formulazioni combinate di insuline ad azione rapida e protratta, che consentono ai pazienti di ottenere un profilo insulinico che emula più da vicino la secrezione di insulina endogena. Oltre alle applicazioni terapeutiche, l'insulina viene impiegata in varie linee cellulari, tra cui CHO-s, HEK 293 e Sf9, per la produzione di anticorpi monoclonali, vaccini virali e prodotti di terapia genica.

L'insulina viene generalmente somministrata tramite iniezione sottocutanea utilizzando siringhe monouso con aghi, una pompa per insulina o penne per insulina riutilizzabili dotate di aghi monouso. L'insulina per inalazione è disponibile in commercio anche nel mercato degli Stati Uniti.

L'ago per penna monouso Dispovan, prodotto da HMD, è stato introdotto in India come il primo ago per penna per insulina progettato per facilitare l'autosomministrazione. Questi aghi per penna incorporano pareti extra sottili e una punta rastremata con più smussi, caratteristiche destinate a migliorare il comfort del paziente riducendo il dolore e ottimizzando la somministrazione dei farmaci. La strategia di distribuzione del prodotto si concentra sul rendere gli aghi per penna accessibili e convenienti nelle regioni in via di sviluppo del paese. Inoltre, il loro design universale garantisce la compatibilità con varie penne per insulina.

A differenza di numerosi agenti farmaceutici, l'insulina non può essere somministrata per via orale perché, analogamente alla maggior parte delle proteine ​​introdotte nel tratto gastrointestinale, subisce una degradazione proteolitica in frammenti inattivi. Di conseguenza, gli sforzi di ricerca si sono concentrati sullo sviluppo di metodi per proteggere l'insulina dagli enzimi digestivi, consentendo così la somministrazione orale o sublinguale.

Nel 2021, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha incorporato l'insulina nel suo elenco modello di farmaci essenziali.

Nel Regno Unito, il Servizio sanitario nazionale fornisce gratuitamente insulina e tutti gli altri farmaci necessari alle persone affette da diabete.

Indagini storiche

Rilevamento iniziale

Nel 1869, Paul Langerhans, uno studente di medicina a Berlino, osservò ammassi di tessuti precedentemente non identificati dispersi all'interno della struttura pancreatica durante un esame al microscopio. La funzione precisa di questi "piccoli mucchi di cellule", successivamente designati come isolotti di Langerhans, era inizialmente indeterminata. Tuttavia, Édouard Laguesse in seguito propose che queste strutture potessero generare secrezioni cruciali per la regolazione della digestione. Anche Archibald Langerhans, figlio di Paul, contribuì a chiarire questa funzione regolatrice.

Nel 1889, il medico Oskar Minkowski, in collaborazione con Joseph von Mering, estirpò il pancreas da un cane sano per indagare sulla sua presunta funzione digestiva. La successiva analisi delle urine ha rivelato la presenza di zucchero, stabilendo così il collegamento inaugurale tra pancreas e diabete. Un progresso significativo si verificò nel 1901 quando il medico e scienziato americano Eugene Lindsay Opie localizzò il ruolo del pancreas nelle isole di Langerhans, affermando: "Diabete mellito quando il risultato di una lesione del pancreas è causato dalla distruzione delle isole di Langerhans e si verifica solo quando questi corpi sono parzialmente o completamente distrutti".

Durante i due decenni successivi, i ricercatori hanno intrapreso molteplici sforzi per isolare le secrezioni dalle isole. Nel 1906, George Ludwig Zuelzer ottenne un successo limitato nel trattamento canino utilizzando un estratto pancreatico, sebbene non potesse sostenere le sue ricerche. Dal 1911 al 1912 E.L. Scott dell'Università di Chicago fece esperimenti con estratti acquosi pancreatici, osservando "una leggera diminuzione della glicosuria"; tuttavia, il suo direttore non è rimasto convinto del merito della ricerca, portandola alla sua conclusione. Israel Kleiner dimostrò effetti comparabili alla Rockefeller University nel 1915, ma la Prima Guerra Mondiale interruppe i suoi sforzi, impedendo il suo ritorno al progetto.

Nel 1916, Nicolae Paulescu formulò un estratto pancreatico acquoso che, dopo la somministrazione a un cane diabetico, mostrò un'influenza normalizzante sulle concentrazioni di glucosio nel sangue. Il suo lavoro sperimentale fu interrotto dalla prima guerra mondiale. Nel 1921 scrisse quattro articoli che descrivevano in dettaglio la sua ricerca condotta a Bucarest e le sue sperimentazioni su un cane diabetico. Successivamente, nello stesso anno, pubblicò "Ricerca sul ruolo del pancreas nell'assimilazione alimentare".

Il termine "insulina" fu introdotto da Edward Albert Sharpey-Schafer nel 1916 per denotare un'ipotetica molecola, che si teorizza fosse sintetizzata dalle isole pancreatiche di Langerhans (derivato dal latino insula, che significa isolotto o isola), responsabile della regolazione del metabolismo del glucosio. All'insaputa di Sharpey-Schafer, Jean de Meyer aveva già proposto nel 1909 il termine molto simile "insulina" per la molecola identica.

Estrazione e Purificazione

Nell'ottobre 1920, il ricercatore canadese Frederick Banting ipotizzò che le secrezioni digestive precedentemente studiate da Minkowski stessero degradando la secrezione delle isole, impedendo così il successo dell'estrazione. In qualità di chirurgo esperto, Banting capì che la legatura del dotto pancreatico avrebbe indotto atrofia nella maggior parte del pancreas preservando le isole di Langerhans. Egli ipotizzò che dalle isole si potesse ottenere un estratto relativamente puro una volta che la maggior parte del tessuto pancreatico fosse degenerata. Ha registrato una nota personale: "Ligare i dotti pancreatici del cane. Mantenere i cani in vita finché gli acini non degenerano lasciando le isole. Cercare di isolare la secrezione interna di questi + alleviare la glicosurea[sic]."

Nella primavera del 1921, Banting si recò a Toronto per presentare il suo concetto a John Macleod, professore di fisiologia all'Università di Toronto. Macleod inizialmente espresse scetticismo, data la mancanza di esperienza di ricerca e la scarsa familiarità di Banting con la letteratura contemporanea; tuttavia, acconsentì a fornire strutture di laboratorio a Banting per indagare sulle sue ipotesi. Macleod fece anche in modo che due studenti universitari servissero come assistenti di laboratorio di Banting per l'estate, sebbene Banting alla fine ne richiedesse solo uno. Charles Best e Clark Noble hanno deciso con il lancio della moneta, con Best che ha vinto e ha iniziato il turno iniziale. Questo risultato si è rivelato svantaggioso per Noble, poiché Banting ha mantenuto Best per l'intera estate e successivamente ha condiviso metà del premio in denaro del Premio Nobel e del riconoscimento per la scoperta con Best. Il 30 luglio 1921, Banting e Best isolarono con successo un estratto, chiamato "isletin", dalle isole di un canino legato al dotto. Dopo l'iniezione in un cane diabetico, questo estratto ha ridotto i livelli di glucosio nel sangue del 40% entro un'ora.

Al ritorno di Macleod a Toronto nell'autunno del 1921, Banting e Best presentarono le loro scoperte; tuttavia, Macleod ha identificato le carenze nel disegno sperimentale e ha raccomandato una replica degli esperimenti utilizzando un numero maggiore di canini e una strumentazione migliorata. Successivamente, trasferì Banting and Best in una struttura di laboratorio superiore e iniziò a remunerare Banting con le borse di ricerca assegnategli. Alcune settimane dopo, anche la successiva fase sperimentale si dimostrò vincente, portando Macleod a facilitare la pubblicazione privata dei risultati a Toronto nel novembre di quell'anno. Di fronte al laborioso processo di legatura dei dotti pancreatici canini e al dover sopportare diverse settimane per l'estrazione dell'insulina, Banting concepì l'approccio innovativo di isolare l'insulina dai pancreas fetali dei vitelli, che non hanno ghiandole digestive sviluppate. A dicembre erano riusciti anche a estrarre l’insulina dai pancreas bovini maturi. Macleod successivamente cessò tutti gli altri sforzi di ricerca all'interno del suo laboratorio per dedicarsi esclusivamente alla purificazione dell'insulina. Ha esteso un invito al biochimico James Collip per aiutarlo in questa impresa e il team ha previsto di essere pronto per le sperimentazioni cliniche entro un mese.

L'11 gennaio 1922, Leonard Thompson, un paziente diabetico di 14 anni in condizioni critiche presso il Toronto General Hospital, ricevette la prima iniezione di insulina. Tuttavia, la notevole impurità dell'estratto provocò in Thompson una grave reazione allergica, che portò all'annullamento delle iniezioni successive. Per i successivi 12 giorni, Collip lavorò diligentemente per perfezionare l'estratto pancreatico bovino. Una seconda somministrazione è avvenuta il 23 gennaio, risolvendo efficacemente la glicosuria caratteristica del diabete senza indurre effetti avversi riconoscibili. Elizabeth Hughes, figlia del segretario di Stato americano Charles Evans Hughes, divenne la prima paziente americana. Il primo paziente trattato negli Stati Uniti fu James D. Havens, che in seguito divenne un importante artista della xilografia; John Ralston Williams ha facilitato tutto ciò importando insulina da Toronto a Rochester, New York, per il trattamento di Havens.

Banting e Best hanno costantemente avuto difficoltà a collaborare con Collip, percependolo come una presenza invadente, il che ha portato alla pronta partenza di Collip dal progetto. Per tutta la primavera del 1922, Best perfezionò con successo le sue metodologie, consentendo l'estrazione di notevoli quantità di insulina secondo necessità, sebbene la preparazione conservasse impurità. La Eli Lilly and Company, un'azienda farmaceutica, aveva esteso un'offerta di assistenza poco dopo le prime pubblicazioni nel 1921, offerta che fu accettata in aprile. A novembre, George B. Walden, capo chimico della Lilly, identificò la precipitazione isoelettrica, consentendo così la produzione di volumi significativi di insulina altamente purificata. Successivamente, l'insulina è diventata disponibile in commercio al pubblico.

Considerazioni sui brevetti

Alla fine di gennaio 1922, le crescenti tensioni tra i quattro "co-scopritori" dell'insulina portarono Collip a contemplare brevemente di brevettare in modo indipendente la sua metodologia di purificazione. Di conseguenza, John G. FitzGerald, che dirigeva l'ente sanitario pubblico non commerciale Connaught Laboratories, è intervenuto per mediare la controversia. Il successivo accordo, formalizzato il 25 gennaio 1922, prevedeva due condizioni principali: 1) i collaboratori dovevano stipulare un contratto che impedisse loro di ottenere un brevetto con qualsiasi azienda farmaceutica commerciale durante un primo periodo di collaborazione con Connaught; e 2) qualsiasi modifica alla politica di ricerca richiedeva una consultazione preventiva tra FitzGerald e i quattro collaboratori. Questo accordo è servito a mitigare i disaccordi e ad allineare la ricerca con la missione di salute pubblica di Connaught.

Inizialmente, Macleod e Banting hanno espresso notevoli riserve sulla brevettabilità del loro processo di produzione di insulina, citando l'etica medica. Tuttavia, persisteva la preoccupazione riguardo alla possibilità che un terzo privato si appropriasse e monopolizzasse la ricerca (una possibilità suggerita da Eli Lilly and Company) e alla sfida di garantire una distribuzione sicura senza adeguati meccanismi di controllo della qualità. In risposta, Edward Calvin Kendall fornì consigli cruciali. Kendall aveva precedentemente isolato la tiroxina presso la Mayo Clinic nel 1914, brevettando successivamente il processo tramite un accordo che coinvolgeva lui stesso, i fratelli Mayo e l'Università del Minnesota, trasferendo infine il brevetto all'università pubblica. Il 12 aprile, Banting, Best, Collip, Macleod e FitzGerald hanno indirizzato collettivamente una lettera al presidente dell'Università di Toronto, proponendo un accordo analogo per assegnare un brevetto al consiglio di amministrazione dell'università. La corrispondenza sottolineava quanto segue:

L'unico scopo del brevetto sarebbe quello di impedire ad altre entità di ottenere un brevetto proprietario. Dopo la pubblicazione della metodologia di preparazione dettagliata, chiunque sarebbe libero di produrre l'estratto, ma nessuna parte potrebbe stabilire un monopolio lucroso.

Il trasferimento del brevetto dell'insulina al Consiglio dei governatori dell'Università di Toronto fu finalizzato il 15 gennaio 1923, per una tassa nominale di $ 1,00. Questa disposizione fu lodata in The World's Work nel 1923 come "un passo avanti nell'etica medica". Negli anni 2010, ha ottenuto un notevole controllo da parte dei media riguardo all'accessibilità sanitaria e farmaceutica.

In seguito alle preoccupazioni sugli sforzi di Eli Lilly per garantire brevetti separati per componenti specifici del processo di produzione dell'insulina, Robert Defries, vicedirettore di Connaught e capo della divisione insulina, ha istituito una politica di condivisione dei brevetti. Questa politica imponeva che tutti i produttori condividessero apertamente eventuali progressi nel processo di produzione, garantendo così una continua convenienza.

Analisi e sintesi strutturale

Inizialmente, l'insulina purificata di derivazione animale costituiva l'unica forma accessibile sia per la ricerca sperimentale che per l'uso terapeutico nei pazienti diabetici. John Jacob Abel ottenne la prima cristallizzazione dell'insulina nel 1926. La natura proteica dell'insulina fu inizialmente suggerita da Michael Somogyi, Edward A. Doisy e Philip A. Shaffer nel 1924 e confermata definitivamente nel 1935 quando Hans Jensen e Earl A. Evans Jr. isolarono con successo gli aminoacidi fenilalanina e prolina.

Frederick Sanger ha chiarito per primo la sequenza aminoacidica dell'insulina nel 1951. Contemporaneamente, a metà degli anni '60, l'insulina sintetica iniziale è stata sviluppata nei laboratori di Panayotis Katsoyannis presso l'Università di Pittsburgh e Helmut Zahn presso l'Università RWTH di Aachen. Ricercatori cinesi sintetizzarono con successo l'insulina bovina cristallina nel 1965. La struttura tridimensionale completa dell'insulina fu successivamente risolta attraverso la cristallografia a raggi X nel laboratorio di Dorothy Hodgkin nel 1969.

Hans E. Weber identificò la preproinsulina nel 1974 mentre prestava servizio come ricercatore presso l'Università della California, a Los Angeles. Durante il periodo 1973-1974, Weber acquisì competenza nelle tecniche per l'isolamento, la purificazione e la traduzione dell'RNA messaggero. Per far avanzare la ricerca sull'insulina, si procurò tessuti pancreatici, inizialmente da un macello di Los Angeles e successivamente dal bestiame dell'UCLA. Ha isolato e purificato con successo l'RNA messaggero totale dalle cellule delle isole pancreatiche, che è stato poi tradotto all'interno di ovociti di Xenopus laevis e successivamente precipitato utilizzando anticorpi anti-insulina. L'analisi della proteina tradotta totale tramite elettroforesi su gel SDS-poliacrilammide e centrifugazione in gradiente di saccarosio ha rivelato picchi distinti corrispondenti a insulina e proinsulina. Inaspettatamente, Weber isolò anche un terzo picco, indicativo di una molecola più grande della proinsulina. Ripetute sperimentazioni hanno mostrato costantemente questo picco prominente che precede la proinsulina, portandolo a concludere che rappresentasse una molecola precursore più grande a monte della proinsulina. Nel maggio 1975, al convegno dell'American Diabetes Association a New York, Weber presentò formalmente le sue scoperte, diventando il primo a designare questa molecola precursore "preproinsulina". Dopo questa presentazione, Donald Steiner, un ricercatore noto per i suoi contributi alla caratterizzazione della proinsulina, ha invitato Weber a discutere la sua ricerca. Nell'aprile 1976, un anno dopo, Steiner caratterizzò e sequenziale ulteriormente questa molecola, riconoscendo esplicitamente il lavoro pionieristico e la scoperta di Weber. La preproinsulina è successivamente emersa come una molecola cruciale per studiare i meccanismi di trascrizione e traduzione.

La prima insulina umana sintetica (ricombinante) geneticamente modificata è stata sintetizzata nel 1978 utilizzando E. coli di Arthur Riggs e Keiichi Itakura presso il Beckman Research Institute della Città della Speranza, in collaborazione con Herbert Boyer presso Genentech. Genentech, fondata da Swanson, Boyer ed Eli Lilly and Company, ha successivamente introdotto Humulin, la prima insulina umana biosintetica disponibile in commercio, nel 1982. Attualmente, la forma predominante di insulina utilizzata a livello globale è l'insulina umana ricombinante biosintetica o i suoi analoghi. Più recentemente, un gruppo di ricerca canadese ha adottato un'innovativa strategia ricombinante, sfruttando una pianta di cartamo facilmente coltivabile per produrre insulina significativamente più economica.

L'insulina ricombinante viene sintetizzata utilizzando lievito, tipicamente Saccharomyces cerevisiae, o E. coli. All'interno del lievito, l'insulina può essere ingegnerizzata come una proteina a catena singola che incorpora un sito endoproteasi KexII, che è un omologo del lievito PCI/PCII, progettato per scindere la catena A dell'insulina da una catena B troncata all'estremità C-terminale. Successivamente, una coda C-terminale sintetizzata chimicamente, che include la treonina assente, viene attaccata alla molecola di insulina tramite proteolisi inversa, impiegando la proteasi trypsin, economicamente vantaggiosa. Generalmente, il residuo di lisina su questa coda C-terminale è salvaguardato con un gruppo protettivo chimico per inibire la proteolisi involontaria. La semplicità della sintesi modulare e la sicurezza comparativa delle modifiche all’interno di questa specifica regione spiegano la prevalenza degli analoghi dell’insulina che presentano alterazioni C-terminali, come lispro, aspart e glulisina. Al contrario, metodi come la sintesi Genentech e le sintesi interamente chimiche, esemplificate dall'approccio di Bruce Merrifield, sono meno favoriti. Questa preferenza deriva dalla bassa efficienza di ricombinazione delle due catene di insulina, in gran parte attribuibile alla precipitazione competitiva della catena B dell'insulina.

Premi Nobel

Nel 1923, il comitato del Premio Nobel riconobbe un team dell'Università di Toronto per l'estrazione pratica dell'insulina, assegnando il Premio Nobel a Frederick Banting e John Macleod. Ricevettero il Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel 1923 per la scoperta dell'insulina. Banting, esprimendo indignazione per l'omissione di Best, successivamente ha condiviso il suo premio con Best, mentre Macleod ha prontamente condiviso il suo con James Collip. I diritti di brevetto sull'insulina sono stati successivamente trasferiti all'Università di Toronto per una somma nominale di un dollaro.

Due premi Nobel aggiuntivi sono stati conferiti per la ricerca relativa all'insulina. Frederick Sanger, un biologo molecolare britannico, ha ricevuto il Premio Nobel per la chimica nel 1958 per la sua determinazione della struttura primaria dell'insulina nel 1955. Rosalyn Sussman Yalow è stata insignita del Premio Nobel per la medicina nel 1977 per il suo lavoro pionieristico nello sviluppo del test radioimmunologico per l'insulina.

Diversi altri premi Nobel mostrano anche un'associazione indiretta con l'insulina. George Minot, che ha ricevuto il Premio Nobel nel 1934 per aver sviluppato il primo trattamento efficace contro l’anemia perniciosa, era lui stesso un diabetico. William Castle notò che la scoperta dell'insulina nel 1921, sostenendo la vita di Minot, facilitò di conseguenza la scoperta di una cura per l'anemia perniciosa. Dorothy Hodgkin ha ricevuto un premio Nobel per la chimica nel 1964 per i suoi progressi nella cristallografia, una tecnica che ha successivamente utilizzato per chiarire la struttura molecolare completa dell'insulina nel 1969.

Polemiche

La ricerca pubblicata da Banting, Best, Collip e Macleod ha dettagliato la preparazione di un estratto di insulina purificata ritenuto idoneo per l'applicazione terapeutica umana. Sebbene Paulescu avesse identificato i principi fondamentali del trattamento, il suo estratto salino non era adatto alla somministrazione umana, portando alla sua omissione dal riconoscimento del Premio Nobel del 1923. Ian Murray ha condotto attivamente una campagna per correggere quello che ha definito "il torto storico" riguardante Nicolae Paulescu. Murray ha ricoperto incarichi come professore di fisiologia presso l'Anderson College of Medicine di Glasgow, in Scozia, capo del dipartimento di malattie metaboliche presso un importante ospedale di Glasgow, vicepresidente della British Association of Diabetes e membro fondatore della International Diabetes Federation. Murray ha articolato:

Un riconoscimento insufficiente è stato dato a Paulescu, l'illustre scienziato rumeno, che all'epoca in cui il team di Toronto iniziò le sue ricerche era già riuscito a estrarre l'ormone antidiabetico del pancreas e a dimostrare la sua efficacia nel ridurre l'iperglicemia nei cani diabetici.

In una comunicazione privata, Arne Tiselius, ex capo dell'Istituto Nobel, ha espresso la sua personale convinzione che Paulescu meritasse un pari riconoscimento per il premio del 1923.

Riferimenti

• Collezione delle biblioteche dell'Università di Toronto: la scoperta e lo sviluppo iniziale dell'insulina, 1920-1925.
• Archivi digitali CBC: Banting, Best, Macleod, Collip: la ricerca di una cura per il diabete.
• Animazioni che illustrano l'azione fisiologica dell'insulina (archiviata 9 marzo 2011).
• Dati strutturali completi per UniProt: P01308 (insulina) disponibili tramite PDBe-KB.