Um microscópio, derivado dos termos do grego antigo μικρός (mikrós), que significa 'pequeno', e σκοπέω (skopéō), significando 'olhar (para), examinar, ou inspecionar', funciona como um aparelho de laboratório projetado para o exame de amostras imperceptíveis ao olho humano sem ajuda. A disciplina científica dedicada à investigação de minúsculos objetos e estruturas através da aplicação de um microscópio é denominada microscopia. Consequentemente, o adjetivo 'microscópico' denota uma entidade que permanece invisível sem a ajuda de um microscópio.
Os microscópios são categorizados através de vários esquemas de classificação. Um método predominante envolve distinguir instrumentos com base em sua interação com uma amostra para gerar imagens, o que pode ocorrer por meio da transmissão de luz ou feixes de elétrons através do caminho óptico da amostra, da detecção de emissões de fótons da amostra ou da varredura precisa da superfície de uma amostra nas proximidades usando uma sonda especializada. O microscópio óptico, historicamente o primeiro e ainda o mais utilizado, emprega lentes para refratar a luz visível que passa através de uma amostra finamente preparada, criando assim uma imagem discernível. Outras categorias significativas incluem o microscópio de fluorescência, microscópios eletrônicos (compreendendo microscópios eletrônicos de transmissão e de varredura) e diversas formas de microscópios de sonda de varredura.
Histórico
Embora artefatos semelhantes a lentes tenham sido rastreados há quatro milênios e textos gregos do século V a.C. descrevam as características ópticas de esferas cheias de água, seguidos por séculos de tratados ópticos, a aplicação inicial documentada de microscópios simples, ou lentes de aumento, coincide com a ampla adoção de lentes para óculos no século XIII. Os microscópios compostos, que integram uma lente objetiva posicionada perto da amostra com uma ocular para produzir uma imagem real, surgiram pela primeira vez na Europa por volta de 1620. O inventor preciso permanece não identificado, apesar de inúmeras afirmações históricas. Muitas dessas reivindicações centram-se em centros holandeses de produção de espetáculos, sugerindo a invenção em 1590 por Zacharias Janssen (conforme afirmado por seu filho) ou por seu pai, Hans Martens, ou ambos. Outras reivindicações atribuem a invenção ao seu concorrente, Hans Lippershey, que registrou a patente inaugural do telescópio em 1608, ou ao expatriado Cornelis Drebbel, que supostamente possuía uma versão em Londres em 1619. Galileo Galilei, ocasionalmente creditado com a invenção do microscópio composto, aparentemente descobriu depois de 1610 que seu telescópio poderia ser reorientado para observar objetos minúsculos. Após observar um microscópio composto construído por Drebbel, exibido em Roma em 1624, Galileu desenvolveu seu próprio modelo aprimorado. Em 1625, Giovanni Faber designou formalmente o microscópio composto apresentado por Galileu à Accademia dei Lincei como um microscópio (o próprio Galileu se referiu a ele como o occhiolino, ou 'olhinho'). René Descartes, em sua obra Dioptrique de 1637, detalhou projetos de microscópios incorporando um espelho côncavo, orientado com sua concavidade em direção ao objeto, usado em conjunto com uma lente para iluminar a amostra, que foi montada no ponto focal do espelho.
Evolução da microscopia óptica moderna
A descrição abrangente e inaugural da anatomia microscópica do tecido orgânico, facilitada pela aplicação de um microscópio, foi publicada em 1644 no tratado de Giambattista Odierna, L'occhio della mosca, traduzido como O olho da mosca.
Os microscópios permaneceram em grande parte uma novidade até as décadas de 1660 e 1670, quando naturalistas na Itália, na Holanda e na Inglaterra iniciaram sua aplicação em estudos biológicos. Marcello Malpighi, um cientista italiano que alguns historiadores da biologia consideram o pai da histologia, iniciou o exame das estruturas biológicas com os pulmões. A publicação de Robert Hooke de 1665, Micrographia, influenciou significativamente a área, principalmente devido às suas ilustrações notáveis. Hooke fabricou lentes minúsculas a partir de pequenos glóbulos de vidro, produzidos pela fusão das pontas de fios de vidro fiados. Antonie van Leeuwenhoek deu uma contribuição notável ao conseguir uma ampliação de até 300x com um microscópio simples de lente única. Seu projeto envolveu colocar uma minúscula lente esférica de vidro entre orifícios em duas placas de metal rebitadas, incorporando uma agulha ajustável por parafuso para montagem da amostra. Posteriormente, Van Leeuwenhoek redescobriu de forma independente glóbulos vermelhos (seguindo a observação anterior de Jan Swammerdam) e espermatozóides, contribuindo assim para a popularização de microscópios para visualizar a ultraestrutura biológica. Em 9 de outubro de 1676, van Leeuwenhoek documentou a descoberta de microrganismos.
A eficácia de um microscópio óptico composto depende da qualidade e da aplicação precisa de seu sistema de lentes condensadoras, que focaliza a luz na amostra, e de sua lente objetiva, que captura a luz da amostra para formar uma imagem. Os primeiros instrumentos exibiam limitações até que este princípio fundamental fosse completamente compreendido e refinado entre o final do século XIX e o início do século XX, e até que as lâmpadas elétricas se tornassem acessíveis como fontes de iluminação. Em 1893, August Köhler formulou um princípio crucial de iluminação de amostras, conhecido como iluminação Köhler, que é indispensável para atingir os limites teóricos de resolução do microscópio óptico. Esta técnica de iluminação garante iluminação uniforme e atenua as restrições de contraste e resolução inerentes aos métodos anteriores de iluminação de amostras. Os avanços subsequentes na iluminação de amostras incluíram a descoberta do contraste de fase por Frits Zernike em 1953 e a iluminação de contraste de interferência diferencial por Georges Nomarski em 1955; ambas as inovações permitem a geração de imagens de amostras transparentes e sem coloração.
Microscópios Eletrônicos
Durante o início do século XX, surgiu uma alternativa substancial ao microscópio óptico: um instrumento que emprega um feixe de elétrons em vez de luz para gerar imagens. Em 1931, o físico alemão Ernst Ruska, em colaboração com o engenheiro elétrico Max Knoll, desenvolveu o protótipo inaugural do microscópio eletrônico, especificamente um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O microscópio eletrônico de transmissão opera segundo princípios análogos aos de um microscópio óptico, mas substitui a luz por elétrons e lentes de vidro por eletroímãs. A utilização de elétrons, em vez de luz, facilita uma resolução significativamente melhorada.
O desenvolvimento do microscópio eletrônico de transmissão foi rapidamente sucedido em 1935 pela invenção do microscópio eletrônico de varredura por Max Knoll. Embora os TEMs tenham sido empregados para pesquisas antes da Segunda Guerra Mundial e tenham ganhado ampla popularidade depois disso, o SEM não se tornou comercialmente acessível até 1965.
Os microscópios eletrônicos de transmissão ganharam destaque após a Segunda Guerra Mundial. Ernst Ruska, enquanto estava na Siemens, projetou o primeiro microscópio eletrônico de transmissão comercial e, na década de 1950, começaram conferências científicas significativas dedicadas à microscopia eletrônica. Em 1965, o professor Sir Charles Oatley e seu aluno de pós-graduação Gary Stewart desenvolveram o primeiro microscópio eletrônico de varredura comercial, que a Cambridge Instrument Company comercializou sob o nome "Stereoscan".
Um avanço recente em relação à microscopia eletrônica envolve sua capacidade de identificar vírus. À medida que os microscópios eletrônicos geram imagens claras e visíveis de organelas minúsculas, eles eliminam a necessidade de reagentes para visualizar vírus ou células prejudiciais, oferecendo assim um método mais eficiente para detecção de patógenos.
Microscópios de sonda de varredura
Entre 1981 e 1983, Gerd Binnig e Heinrich Rohrer conduziram pesquisas na IBM em Zurique, Suíça, com foco no fenômeno do tunelamento quântico. Seu trabalho levou ao desenvolvimento de um microscópio de sonda de varredura funcional (SPM), um instrumento derivado da teoria de tunelamento quântico, capaz de detectar forças minúsculas trocadas entre uma sonda e uma superfície de amostra. Este mecanismo depende da proximidade da sonda com a superfície, permitindo um fluxo contínuo de elétrons e, portanto, uma corrente entre a amostra e a sonda. Inicialmente, o microscópio enfrentou ceticismo devido aos intrincados fundamentos teóricos. No entanto, em 1984, Jerry Tersoff e D.R. Hamann, então no Bell Laboratories da AT&T em Murray Hill, Nova Jersey, publicou artigos que correlacionaram com sucesso a estrutura teórica com os resultados experimentais do instrumento. Esta validação teórica foi rapidamente seguida pela introdução de instrumentos comerciais SPM em 1985 e, em 1986, pela invenção do microscópio de força atômica (AFM) por Gerd Binnig, Calvin Quate e Christoph Gerber. Posteriormente, Binnig e Rohrer receberam o Prêmio Nobel de Física por seu trabalho pioneiro no microscópio de sonda de varredura.
O avanço contínuo na usinagem de pontas e sondas ultrafinas facilitou o desenvolvimento contínuo de novos designs de microscópios de sonda de varredura.
Microscópios de fluorescência
Os avanços contemporâneos na microscopia óptica estão predominantemente centrados na proliferação da microscopia de fluorescência na pesquisa biológica. Ao longo das últimas décadas do século 20, especialmente durante a era pós-genômica, surgiram inúmeras metodologias para coloração fluorescente de estruturas celulares. Estas técnicas abrangem principalmente a coloração química direcionada de componentes celulares específicos, como a utilização de DAPI para rotular DNA; a aplicação de anticorpos conjugados com repórteres fluorescentes; e a incorporação de proteínas fluorescentes, exemplificadas pela proteína verde fluorescente. Esses diversos fluoróforos permitem a análise em nível molecular da arquitetura celular em espécimes vivos e preservados.
O surgimento da microscopia de fluorescência impulsionou significativamente a evolução de um design de microscópio moderno e proeminente: o microscópio confocal. Marvin Minsky patenteou o princípio subjacente em 1957; no entanto, a implementação prática desta técnica foi limitada pelo estado nascente da tecnologia laser. Somente em 1978 é que Thomas e Christoph Cremer desenvolveram com sucesso o primeiro microscópio confocal funcional de varredura a laser, levando à rápida adoção da técnica ao longo da década de 1980.
Microscópios de superresolução
Uma parte substancial da pesquisa contemporânea em microscopia óptica, particularmente no início do século 21, centra-se no avanço da análise de super-resolução para amostras marcadas com fluorescência. Métodos como a iluminação estruturada podem melhorar a resolução em aproximadamente duas a quatro vezes, enquanto técnicas como a microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) estão alcançando resoluções comparáveis às dos microscópios eletrônicos. Este progresso aborda o limite de difração inerente à luz ou à excitação, que tradicionalmente restringe a resolução. Stefan Hell recebeu o Prêmio Nobel de Química de 2014 por seu trabalho pioneiro na técnica STED, dividindo o prêmio com Eric Betzig e William Moerner, que adaptaram a microscopia de fluorescência para a visualização de moléculas únicas.
Microscópios de raios X
Microscópios de raios X são instrumentos especializados que empregam radiação eletromagnética, normalmente dentro do espectro de raios X suaves, para obter imagens de vários objetos. Avanços tecnológicos significativos na óptica de lentes de raios X durante o início da década de 1970 estabeleceram esses instrumentos como uma solução prática de imagem. Eles são frequentemente utilizados em tomografia para gerar reconstruções tridimensionais de objetos, incluindo espécimes biológicos que não foram submetidos a fixação química. Os esforços de pesquisa atuais estão focados em melhorar a óptica para raios X duros, que possuem capacidades de penetração superiores.
Tipos
Os microscópios podem ser categorizados em classes distintas com base em vários critérios. Um sistema de classificação diferencia os instrumentos de acordo com o meio que interage com a amostra para produzir uma imagem, especificamente luz ou fótons (microscópios ópticos), elétrons (microscópios eletrônicos) ou uma sonda física (microscópios de sonda de varredura). Um método de classificação alternativo distingue microscópios com base em sua abordagem de análise de amostra: por meio de um ponto de varredura (por exemplo, microscópios ópticos confocal, microscópios eletrônicos de varredura e microscópios de sonda de varredura) ou analisando simultaneamente a amostra inteira (por exemplo, microscópios ópticos de campo amplo e microscópios eletrônicos de transmissão).
Tanto os microscópios ópticos de campo amplo quanto os microscópios eletrônicos de transmissão empregam a teoria das lentes – lentes ópticas para microscópios de luz e lentes eletromagnéticas para microscópios eletrônicos – para ampliar imagens produzidas por ondas transmitidas ou refletidas por uma amostra. As ondas utilizadas são eletromagnéticas em microscópios ópticos ou feixes de elétrons em microscópios eletrônicos. As capacidades de resolução desses microscópios são limitadas pelo comprimento de onda da radiação empregada para geração de imagens, com comprimentos de onda mais curtos permitindo resolução superior. Os microscópios ópticos e eletrônicos de varredura, como o microscópio confocal e o microscópio eletrônico de varredura, utilizam lentes para direcionar um ponto focado de luz ou elétrons para uma amostra. Posteriormente, analisam os sinais resultantes da interação do feixe com a amostra. Este ponto focalizado é então escaneado sistematicamente em toda a amostra para examinar uma área retangular definida. A ampliação da imagem é realizada projetando dados adquiridos de uma região de amostra escaneada em um display comparativamente maior. Esses microscópios estão sujeitos às mesmas limitações de resolução que os microscópios ópticos, de sonda e eletrônicos de campo amplo.
Os microscópios de varredura com sonda analisam de forma semelhante pontos individuais em uma amostra, escaneando posteriormente uma sonda através de uma região retangular para construir uma imagem. Como esses microscópios não dependem de radiação eletromagnética ou eletrônica para geração de imagens, eles estão isentos das restrições de resolução que afetam os microscópios ópticos e eletrônicos.
Microscópio Óptico
O microscópio óptico, representando o tipo de microscópio mais antigo e mais prevalente, é um instrumento óptico equipado com uma ou mais lentes que geram uma imagem ampliada de uma amostra posicionada dentro de seu plano focal. Esses microscópios normalmente incorporam elementos refrativos, como vidro, plástico ou quartzo, para direcionar a luz para o olho do observador ou outro detector sensível à luz. Os microscópios ópticos baseados em espelho funcionam segundo um princípio análogo. Os microscópios de luz padrão, operando com luz visível, normalmente alcançam ampliações de até 1.250×, com um limite de resolução teórico de aproximadamente 0,250 micrômetros ou 250 nanômetros. Esta limitação inerente restringe a ampliação prática a cerca de 1.500×. Embora metodologias especializadas, incluindo microscopia confocal de varredura e Vertico SMI, possam superar essa ampliação, sua resolução permanece limitada pela difração. O emprego de comprimentos de onda mais curtos de luz, como o ultravioleta, oferece um método para melhorar a resolução espacial dos microscópios ópticos, uma capacidade também fornecida por instrumentos como o microscópio óptico de varredura de campo próximo. Sarfus representa uma técnica óptica contemporânea que aumenta a sensibilidade dos microscópios ópticos convencionais, permitindo a visualização direta de filmes nanométricos (tão finos quanto 0,3 nanômetros) e nano-objetos isolados (com diâmetros tão pequenos quanto 2 nanômetros). Este método depende da aplicação de substratos não refletivos em microscopia de luz refletida com polarização cruzada.
A luz ultravioleta facilita a resolução de características microscópicas minúsculas e a geração de imagens de amostras que são visualmente transparentes. Por outro lado, a luz infravermelha próxima pode ser empregada para visualizar circuitos integrados em dispositivos de silício ligados, devido à transparência do silício nesses comprimentos de onda específicos.
A microscopia de fluorescência utiliza um amplo espectro de comprimentos de onda de luz, do ultravioleta ao visível, para induzir fluorescência nas amostras, permitindo assim a observação visualmente ou através de câmeras sensíveis especializadas.
A microscopia de contraste de fase é uma técnica de iluminação óptica que transforma mudanças sutis de fase na luz que atravessa uma amostra transparente em amplitude discernível ou variações de contraste na imagem resultante. Este método elimina a necessidade de coloração para examinar lâminas, permitindo assim o estudo do ciclo celular em células vivas.
O microscópio óptico convencional avançou recentemente para o microscópio digital. Nessa evolução, um sensor semelhante aos encontrados nas câmeras digitais é empregado para capturar uma imagem, que é posteriormente exibida em um monitor de computador, seja em conjunto ou como alternativa à visualização direta pela ocular. Esses sensores podem incorporar tecnologia CMOS ou dispositivo de carga acoplada (CCD), dependendo da aplicação específica.
A microscopia digital, que emprega câmeras digitais sensíveis de contagem de fótons, permite imagens em níveis de luz muito baixos, evitando assim danos a amostras biológicas delicadas. A pesquisa demonstrou que a utilização de uma fonte de luz que gera pares de fótons emaranhados pode minimizar ainda mais o risco de danos às amostras mais fotossensíveis. Nesta aplicação específica de imagem fantasma para microscopia de fótons esparsos, a amostra é iluminada com fótons infravermelhos, cada um dos quais exibe correlação espacial com um parceiro emaranhado no espectro visível, facilitando imagens eficientes por uma câmera de contagem de fótons.
Microscópio eletrônico
Os microscópios eletrônicos compreendem principalmente dois tipos: microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) e microscópios eletrônicos de varredura (SEMs). Ambos os sistemas utilizam uma série de lentes eletromagnéticas e eletrostáticas para focar um feixe de elétrons de alta energia em uma amostra. Em um TEM, os elétrons atravessam a amostra, um processo análogo à microscopia óptica fundamental. Este método requer uma preparação meticulosa da amostra, pois a maioria dos materiais dispersa fortemente os elétrons. Além disso, as amostras devem ser excepcionalmente finas (abaixo de 100 nm) para permitir a penetração de elétrons. Seções transversais de células, quando coradas com ósmio e metais pesados, revelam claramente membranas de organelas e proteínas como ribossomos. Esta técnica atinge uma resolução de 0,1 nm, permitindo a visualização detalhada de vírus (20–300 nm) e cadeias de DNA (2 nm de largura). Por outro lado, os SEMs empregam bobinas raster para escanear a superfície de objetos volumosos com um fino feixe de elétrons. Consequentemente, as amostras não necessitam necessariamente de seccionamento, embora amostras não condutoras possam necessitar de um metal nanométrico ou revestimento de carbono. SEM facilita a visualização rápida da superfície de amostras, potencialmente dentro de um ambiente fino de vapor de água, para evitar a dessecação.
Investigação de sondagem
A variedade diversificada de microscópios de sonda de varredura origina-se dos numerosos tipos de interações que ocorrem quando uma sonda minúscula é escaneada e se envolve com uma amostra. Estas interações, ou modos operacionais, podem ser registradas ou mapeadas em função da localização da superfície para gerar um mapa de caracterização. Os três tipos mais comuns de microscópios de sonda de varredura incluem microscópios de força atômica (AFM), microscópios ópticos de varredura de campo próximo (NSOM ou SNOM, também conhecidos como microscopia óptica de varredura de campo próximo) e microscópios de tunelamento de varredura (STM). Um microscópio de força atômica apresenta uma sonda fina, normalmente feita de silício ou nitreto de silício, fixada em um cantilever; esta sonda varre a superfície da amostra e as forças que medeiam a interação entre a sonda e a superfície são medidas e mapeadas. Um microscópio óptico de varredura de campo próximo compartilha semelhanças com um AFM, mas sua sonda incorpora uma fonte de luz dentro de uma fibra óptica, terminando em uma ponta geralmente equipada com uma abertura para transmissão de luz. Este microscópio pode capturar luz transmitida ou refletida para avaliar propriedades ópticas altamente localizadas da superfície, frequentemente para amostras biológicas. Os microscópios de varredura por tunelamento utilizam uma ponta de metal com um único átomo apical; esta ponta está presa a um tubo através do qual flui uma corrente elétrica. A ponta é escaneada sobre a superfície de uma amostra condutora até que uma corrente de tunelamento seja estabelecida; essa corrente é mantida em um nível constante pelo movimento da ponta controlado por computador, e uma imagem é construída a partir dos movimentos registrados da ponta.
Outros tipos
Os microscópios acústicos de varredura empregam ondas sonoras para quantificar variações na impedância acústica. Operando com base em princípios semelhantes aos do Sonar, esses instrumentos são utilizados para tarefas como a detecção de defeitos subterrâneos em materiais, incluindo aqueles encontrados em circuitos integrados. Em 4 de fevereiro de 2013, engenheiros australianos desenvolveram um “microscópio quântico” capaz de fornecer uma precisão incomparável.
Aplicativos móveis
Os microscópios de aplicação móvel podem funcionar como microscópios ópticos quando a lanterna do dispositivo é ativada. No entanto, esses microscópios baseados em aplicativos móveis apresentam desafios de usabilidade devido ao ruído visual, são frequentemente limitados à ampliação de 40x e são limitados pelas capacidades de resolução inerentes da própria lente da câmera.
Referências
Referências
Marcos em microscopia óptica, Nature Publishing
- Marcos em microscopia óptica, Nature Publishing
- Perguntas frequentes sobre microscópios ópticos (arquivado em 4 de abril de 2009)
- Nikon MicroscopyU, tutoriais fornecidos pela Nikon
- Expressões moleculares: Explorando o mundo da óptica e da microscopia, Florida State University.