Plegamiento de proteínas es el proceso físico en el que una proteína, después de la síntesis ribosómica como una cadena lineal de aminoácidos, pasa de una conformación de espiral aleatoria inestable a una estructura tridimensional más ordenada. Esta transformación estructural permite que la proteína alcance su funcionalidad biológica.
Para numerosas proteínas, el proceso de plegamiento se inicia simultáneamente con la traducción de la cadena polipeptídica. Dentro de este proceso, los aminoácidos participan en interacciones para formar una arquitectura tridimensional definida con precisión, denominada estado nativo de la proteína. Esta conformación está intrínsecamente dictada por su secuencia de aminoácidos, también conocida como estructura primaria.
La estructura tridimensional precisa es fundamental para el funcionamiento adecuado, aunque ciertas regiones de proteínas funcionales pueden permanecer intrínsecamente desordenadas, lo que subraya la importancia de la dinámica de las proteínas. La imposibilidad de adoptar la estructura nativa normalmente da como resultado proteínas inactivas; sin embargo, ciertas proteínas mal plegadas pueden exhibir funcionalidades alteradas o tóxicas. Se plantea la hipótesis de que numerosas patologías neurodegenerativas y de otro tipo surgen de la agregación de fibrillas de amiloide, que están formadas por proteínas mal plegadas; las formas infecciosas de estos se reconocen como priones. Además, varias alergias se atribuyen al plegamiento aberrante de proteínas específicas, ya que el sistema inmunológico puede no generar anticuerpos adecuados contra estas estructuras proteicas atípicas.
La desnaturalización de las proteínas es un proceso que implica la transición de una conformación plegada a una desplegada. Este fenómeno se presenta en diversos escenarios, entre ellos la cocción, las quemaduras térmicas y las proteinopatías. Cualquier estructura residual que persista en el estado aparentemente desplegado puede servir potencialmente como un sitio de inicio del plegamiento, dirigiendo así reacciones de plegamiento posteriores.
La duración del proceso de plegamiento muestra una variabilidad considerable que depende de la proteína específica que se esté investigando. Los estudios in vitro revelan que las proteínas de plegado más lento necesitan minutos o incluso horas para alcanzar su estado plegado, en gran medida atribuible a la isomerización de la prolina, y normalmente atraviesan múltiples estados intermedios, similares a puntos de control, antes de completarse. Por el contrario, las proteínas diminutas de un solo dominio, que comprenden hasta cien aminoácidos, generalmente se pliegan mediante un mecanismo de un solo paso. Las escalas de tiempo de milisegundos son habituales para estos, y las reacciones de plegamiento de proteínas más rápidas conocidas concluyen en apenas microsegundos. La escala de tiempo de plegamiento de una proteína depende de su tamaño, orden de contacto y topología del circuito.
Comprender y simular el proceso de plegamiento de proteínas ha constituido un desafío importante para la biología computacional desde finales de los años 1960.
El proceso de plegamiento de proteínas
Estructura primaria
La estructura primaria de una proteína, definida por su secuencia lineal de aminoácidos, dicta su conformación nativa. Los residuos de aminoácidos específicos y sus posiciones dentro de la cadena polipeptídica son determinantes críticos de cómo regiones específicas de la proteína interactúan y se fusionan para formar su conformación tridimensional. La composición general de aminoácidos es menos crítica que la secuencia precisa. Sin embargo, un principio fundamental del plegamiento es que la secuencia de aminoácidos de cada proteína codifica intrínsecamente la información que especifica tanto su estructura nativa como la ruta cinética para alcanzar ese estado. Sin embargo, esto no implica que secuencias de aminoácidos casi idénticas adopten invariablemente estructuras plegadas similares. Las conformaciones también pueden divergir debido a factores ambientales; por lo tanto, proteínas análogas pueden exhibir distintos patrones de plegamiento dependiendo de su contexto celular o extracelular.
Estructura secundaria
La formación de la estructura secundaria representa la etapa inicial en la ruta de plegamiento de proteínas hacia su estructura nativa. Los elementos estructurales secundarios clave incluyen hélices alfa y láminas beta, que se pliegan rápidamente debido a la estabilización mediante enlaces de hidrógeno intramoleculares, un fenómeno caracterizado inicialmente por Linus Pauling. El establecimiento de enlaces de hidrógeno intramoleculares constituye un factor importante que contribuye a la estabilidad de las proteínas. Las alfa-hélices se generan mediante enlaces de hidrógeno dentro de la columna vertebral del polipéptido, lo que da como resultado una conformación en espiral. Las láminas con pliegues beta surgen cuando la columna vertebral del polipéptido se pliega sobre sí misma, formando enlaces de hidrógeno. Estos enlaces de hidrógeno se producen entre el hidrógeno amida y el oxígeno carbonilo de enlaces peptídicos adyacentes. Existen láminas plisadas beta tanto antiparalelas como paralelas; el primero muestra una mayor estabilidad de los enlaces de hidrógeno debido a la alineación ideal de 180 grados de los enlaces de hidrógeno, en contraste con los enlaces de hidrógeno inclinados, menos óptimos, que se observan en láminas paralelas.
Estructura terciaria
Las hélices alfa y las láminas beta frecuentemente exhiben propiedades anfipáticas y poseen regiones tanto hidrofílicas como hidrofóbicas. Esta característica facilita la formación de la estructura terciaria de una proteína, donde el plegamiento ordena los segmentos hidrofílicos hacia el entorno acuoso y los segmentos hidrofóbicos hacia el núcleo hidrofóbico de la proteína. La formación de la estructura terciaria sigue jerárquicamente la estructura secundaria. Una vez que la estructura terciaria de una proteína se establece y estabiliza mediante interacciones hidrófobas, también se pueden formar puentes disulfuro covalentes entre dos residuos de cisteína. Estas interacciones covalentes y no covalentes adoptan una disposición topológica específica dentro de la conformación nativa de una proteína. Si bien la estructura terciaria pertenece a una única cadena polipeptídica, interacciones adicionales entre cadenas polipeptídicas plegadas conducen al desarrollo de una estructura cuaternaria.
Estructura Cuaternaria
En determinadas proteínas, la estructura terciaria puede progresar hasta la formación de una estructura cuaternaria, que normalmente implica el ensamblaje o coensamblaje de subunidades ya plegadas. Esto significa que múltiples cadenas polipeptídicas interactúan para constituir una proteína cuaternaria completamente funcional.
Fuerzas impulsoras del plegamiento de proteínas
El plegamiento de proteínas constituye un proceso espontáneo impulsado principalmente por interacciones hidrofóbicas, la formación de enlaces de hidrógeno intramoleculares y fuerzas de van der Waals, mientras que es contrarrestado por la entropía conformacional. La escala de tiempo para el plegamiento de una proteína aislada depende de su tamaño, orden de contacto y topología del circuito. Dentro de los entornos celulares, el plegamiento frecuentemente comienza de forma cotraduccional, donde el extremo N de la proteína comienza a plegarse incluso cuando el segmento C-terminal todavía está experimentando síntesis ribosómica. Sin embargo, una molécula de proteína también puede plegarse espontáneamente durante o después de su biosíntesis. Aunque estas macromoléculas a menudo se consideran autoplegables, el proceso también se ve influenciado por el disolvente (p. ej., agua o bicapa lipídica), la concentración de sal, el pH, la temperatura y la presencia potencial de cofactores y chaperonas moleculares.
Las capacidades de plegado de proteínas están limitadas por los ángulos de flexión limitados y las conformaciones estéricamente permitidas. Estos ángulos permitidos para el plegamiento de proteínas se caracterizan por el gráfico bidimensional de Ramachandran, que ilustra los ángulos de rotación psi y phi permitidos.
Efecto hidrofóbico
Para que el plegamiento de proteínas se produzca como una reacción espontánea dentro de una célula, debe ser termodinámicamente favorable. Dado que el plegamiento de proteínas es de hecho un proceso espontáneo, necesariamente presenta un valor de energía libre de Gibbs negativo. En el contexto del plegamiento de proteínas, la energía libre de Gibbs está directamente correlacionada tanto con la entalpía como con la entropía. En consecuencia, para que se manifieste un cambio negativo en la energía libre de Gibbs (ΔG) y para que el plegamiento de proteínas sea termodinámicamente favorable, el término de entalpía, el término de entropía o ambos deben ser favorables.
La minimización de la exposición de las cadenas laterales hidrofóbicas al agua constituye una fuerza impulsora importante en el plegamiento de proteínas. Este fenómeno, denominado efecto hidrofóbico, implica el secuestro de segmentos hidrofóbicos de una proteína en su interior, lejos del entorno hidrofílico circundante. Dentro de un medio acuoso, las moléculas de agua tienden a fusionarse alrededor de regiones hidrofóbicas, formando "capas de agua" o "jaulas" estructuradas. Este ordenamiento localizado de las moléculas de agua alrededor de áreas hidrofóbicas disminuye la entropía del sistema. El confinamiento de las moléculas de agua dentro de estas jaulas impulsa el colapso hidrofóbico, que es el plegamiento hacia adentro de los grupos hidrofóbicos. Posteriormente, este colapso restaura la entropía del sistema al alterar estas jaulas de agua, liberando así las moléculas de agua previamente ordenadas. Las extensas interacciones entre numerosos grupos hidrófobos dentro del núcleo de una proteína plegada globular mejoran sustancialmente su estabilidad posterior al plegamiento, principalmente debido al efecto acumulativo de las fuerzas de van der Waals, particularmente las fuerzas de dispersión de London. Termodinámicamente, el efecto hidrofóbico funciona como fuerza impulsora exclusivamente en presencia de un medio acuoso que contiene una molécula anfifílica con un dominio hidrofóbico sustancial. Además, la estabilidad del estado nativo está influenciada por el contexto ambiental de los enlaces de hidrógeno; aquellos incrustados dentro de un núcleo hidrofóbico contribuyen de manera más significativa que aquellos expuestos al ambiente acuoso.
Dentro de las proteínas que exhiben pliegues globulares, los aminoácidos hidrofóbicos generalmente se intercalan a lo largo de la secuencia primaria, en lugar de mostrar una distribución o agregación aleatoria. Por el contrario, las proteínas que han surgido recientemente de novo, a menudo caracterizadas por un desorden intrínseco, exhiben un patrón contrastante en el que los aminoácidos hidrófobos tienden a agruparse a lo largo de la secuencia primaria.
Chaperones
Las chaperonas moleculares representan una clase de proteínas que facilitan el plegamiento preciso de otras proteínas in vivo. Estas chaperonas están omnipresentes en todos los compartimentos celulares e interactúan con cadenas polipeptídicas para permitir la formación de la conformación tridimensional nativa de la proteína. Fundamentalmente, las propias chaperonas no se incorporan a la estructura final de las proteínas a las que ayudan. Su participación puede comenzar incluso durante la síntesis del polipéptido naciente por parte del ribosoma. Las chaperonas moleculares funcionan uniéndose y estabilizando estructuras intermedias que de otro modo serían inestables dentro de la vía de plegamiento de una proteína. Sin embargo, las chaperonas no poseen la información intrínseca que dicta la estructura nativa correcta de sus proteínas cliente; en cambio, su mecanismo implica evitar la adopción de conformaciones de plegado incorrectas. En consecuencia, las chaperonas no aceleran la velocidad de los pasos individuales en la vía de plegamiento hacia la estructura nativa. Más bien, mitigan el potencial de agregaciones indeseables de cadenas polipeptídicas que podrían impedir la búsqueda de intermediarios adecuados, proporcionando así una ruta más eficiente para que la cadena polipeptídica alcance sus conformaciones correctas. Es importante diferenciar las chaperonas de las proteínas catalizadoras del plegamiento, que catalizan químicamente pasos lentos en las vías de plegamiento. Ejemplos de tales catalizadores incluyen isomerasas disulfuro de proteínas y isomerasas peptidil-prolil, que participan en la formación de enlaces disulfuro o la interconversión entre estereoisómeros cis y trans de grupos peptídicos, respectivamente. Se ha demostrado que las chaperonas son fundamentales para el plegamiento de proteínas in vivo porque confieren la asistencia necesaria para que las proteínas logren sus alineamientos y conformaciones adecuadas con suficiente eficiencia para ser "biológicamente relevantes". Si bien en teoría las cadenas polipeptídicas pueden plegarse en sus estructuras nativas sin la ayuda de chaperonas, como lo demuestran los experimentos de plegamiento de proteínas in vitro, este proceso suele ser demasiado ineficiente o prolongado para los sistemas biológicos. Por lo tanto, las chaperonas son indispensables para el plegamiento de proteínas in vivo. Más allá de su papel en la formación de estructuras nativas, las chaperonas están implicadas en diversos procesos celulares, incluido el transporte y la degradación de proteínas e incluso permiten que las proteínas desnaturalizadas, cuando se exponen a ciertos factores desnaturalizantes externos, se repliquen en sus estructuras nativas correctas.
Una proteína completamente desnaturalizada carece de estructura terciaria y secundaria, existiendo en cambio como una espiral aleatoria. Si bien algunas proteínas pueden replegarse en condiciones específicas, la desnaturalización suele ser irreversible. Las células emplean enzimas llamadas proteínas de choque térmico, un tipo de chaperona, para proteger sus proteínas de los efectos desnaturalizantes del calor. Estos acompañantes facilitan el plegamiento adecuado de las proteínas y ayudan a mantener su estado plegado. La presencia ubicua de proteínas de choque térmico en todas las especies examinadas, desde bacterias hasta humanos, sugiere su origen evolutivo temprano y su función biológica crítica. Además, ciertas proteínas necesitan la ayuda de chaperonas para plegarse dentro de las células, ya sea aislando proteínas individuales para evitar interacciones disruptivas o desplegando proteínas mal plegadas para permitir su replegamiento en la conformación nativa correcta. Esta función es vital para prevenir la precipitación de proteínas en agregados amorfos insolubles. Los factores externos que contribuyen a la desnaturalización de las proteínas o la alteración de su estado nativo incluyen la temperatura, los campos externos (eléctricos, magnéticos), el hacinamiento molecular y el confinamiento espacial, todos los cuales influyen significativamente en el plegamiento de las proteínas. Las altas concentraciones de solutos, los niveles extremos de pH, las fuerzas mecánicas y la presencia de desnaturalizantes químicos también inducen la desnaturalización de las proteínas. En conjunto, estos factores se clasifican como tensiones celulares. Se observa que las concentraciones de chaperona aumentan durante los períodos de estrés celular, lo que ayuda al plegamiento correcto de las proteínas nacientes, así como al replegamiento de las desnaturalizadas o mal plegadas.
Las proteínas pueden no adoptar sus formas bioquímicamente funcionales en diversas condiciones. Las temperaturas fuera del rango fisiológico típico de las células pueden inducir el despliegue o la desnaturalización de proteínas térmicamente inestables, como lo ejemplifica la opacificación de la clara de huevo al hervirla. Sin embargo, la estabilidad térmica de las proteínas es muy variable; por ejemplo, las arqueas hipertermófilas prosperan a temperaturas de hasta 122 °C, lo que requiere que todo su complemento de proteínas esenciales y conjuntos de proteínas permanezca estable a esta temperatura o por encima de ella.
La bacteria E. coli sirve como huésped del bacteriófago T4. La proteína gp31 codificada por fagos (P17313) exhibe homología estructural y funcional con la proteína E. coli proteína chaperona GroES, y puede sustituirla funcionalmente durante el ensamblaje de partículas del virus bacteriófago T4 durante la infección. Al igual que GroES, gp31 forma un complejo estable con la chaperonina GroEL, un complejo absolutamente esencial para el plegamiento y ensamblaje in vivo de la proteína gp23 de la cápsida principal del bacteriófago T4.
Cambio de pliegue de proteínas
Algunas proteínas poseen múltiples estructuras nativas, alterando su conformación en respuesta a señales externas específicas. Por ejemplo, la proteína KaiB sufre cambios diarios, funcionando como un reloj circadiano en las cianobacterias. Las estimaciones sugieren que aproximadamente entre el 0,5 % y el 4 % de las proteínas catalogadas en el Protein Data Bank (PDB) presentan cambios de pliegue.
Mal plegamiento de proteínas y enfermedades neurodegenerativas
Se considera que una proteína está mal plegada si no logra alcanzar su estado nativo normal. Esto puede deberse a mutaciones en la secuencia de aminoácidos o a factores externos que interrumpen el proceso de plegamiento estándar. Las proteínas mal plegadas suelen presentar láminas β dispuestas en una arquitectura supramolecular conocida como estructura β cruzada. Estos conjuntos ricos en láminas β se caracterizan por una estabilidad excepcional, alta insolubilidad y resistencia general a la proteólisis. La integridad estructural de estos conjuntos fibrilares surge de interacciones extensas entre monómeros de proteínas, principalmente a través de enlaces de hidrógeno principales que conectan sus cadenas β. El plegamiento incorrecto de proteínas puede iniciar una cascada, promoviendo un mayor plegamiento incorrecto y acumulación de otras proteínas en agregados u oligómeros. Los niveles celulares elevados de proteínas agregadas conducen a la formación de estructuras similares a amiloide, que están implicadas en trastornos degenerativos y muerte celular. Los amiloides son estructuras fibrilares compuestas de agregados de proteínas convertidas, que presentan enlaces de hidrógeno intermoleculares que los hacen altamente insolubles. En consecuencia, la vía del proteosoma puede resultar insuficiente para degradar estas proteínas mal plegadas antes de que se agreguen. Las proteínas mal plegadas pueden interactuar entre sí, formando agregados estructurados y adquiriendo toxicidad a través de estas asociaciones intermoleculares.
Las proteínas agregadas están implicadas en una variedad de afecciones debilitantes, incluidas enfermedades relacionadas con priones como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad de las vacas locas). También son fundamentales para los trastornos relacionados con el amiloide, como la enfermedad de Alzheimer, la miocardiopatía amiloide familiar y la polineuropatía, además de las enfermedades de agregación intracelular como la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson. Estas afecciones neurodegenerativas que aparecen con la edad se caracterizan por la acumulación de proteínas mal plegadas en agregados extracelulares insolubles o inclusiones intracelulares, que a menudo forman fibrillas de β-amiloide cruzadas. El papel preciso de estos agregados, ya sea que sean agentes causales o meros indicadores de la alteración de la homeostasis de las proteínas (el equilibrio entre síntesis, plegamiento, agregación y recambio), sigue siendo un área de investigación activa. Recientemente, la Agencia Europea de Medicamentos autorizó Tafamidis (también conocido como Vyndaqel), un estabilizador cinético de la transtiretina tetramérica, para el tratamiento de las enfermedades amiloides de la transtiretina. Esta autorización implica que la degeneración patológica del tejido posmitótico en las enfermedades amiloides humanas está impulsada por el proceso de formación de fibrillas de amiloide en sí, más que por las fibrillas preformadas. Por el contrario, el plegamiento incorrecto y la degradación excesiva posterior, en lugar del plegamiento y la función adecuados, contribuyen a diversas enfermedades proteopatías, incluido el enfisema asociado a antitripsina, la fibrosis quística y las enfermedades por almacenamiento lisosomal, donde la patología primaria surge de una pérdida de la función de las proteínas. Si bien la terapia de reemplazo de proteínas tradicionalmente ha abordado estos últimos trastornos, una estrategia terapéutica innovadora implica el empleo de chaperonas farmacéuticas para facilitar el plegamiento correcto de las proteínas mutadas, restaurando así su funcionalidad.
Metodologías experimentales para investigar el plegamiento de proteínas
Aunque se pueden obtener conocimientos sobre el plegamiento de proteínas a partir de análisis mutacionales, los enfoques experimentales predominantes implican inducir el despliegue o replegamiento gradual de las proteínas y, posteriormente, monitorear sus transiciones conformacionales utilizando métodos no cristalográficos convencionales.
Cristalografía de rayos X
La cristalografía de rayos X se presenta como una técnica crucial y muy eficaz para dilucidar la configuración tridimensional de una proteína plegada. Para que la cristalografía de rayos X tenga éxito, primero se debe incorporar la proteína de interés a una red cristalina. Este proceso requiere identificar un solvente de cristalización apropiado, lograr concentraciones sobresaturadas de la proteína pura en solución y posteriormente inducir la precipitación de cristales. Una vez cristalizada, la red de proteínas se puede irradiar con haces de rayos X concentrados, que luego se difractan y dispersan en múltiples direcciones. Los haces difractados resultantes proporcionan información directamente correlacionada con la disposición tridimensional específica de la proteína dentro del cristal. Los rayos X interactúan precisamente con las nubes de electrones que envuelven a los átomos individuales dentro de la red cristalina de proteínas, generando un patrón de difracción distinto. Sin embargo, interpretar este patrón requiere correlacionar las nubes de densidad de electrones con la amplitud de los rayos X, un paso complicado por la necesidad de inferir las fases o los ángulos de fase involucrados. Sin el marco matemático proporcionado por la transformada de Fourier, este "problema de fase" haría que la predicción de patrones de difracción fuera extremadamente desafiante. Sin embargo, técnicas avanzadas como la sustitución isomorfa múltiple utilizan la presencia de iones de metales pesados para inducir una difracción de rayos X más predecible, reduciendo así la complejidad variable y resolviendo eficazmente el problema de fase.
Espectroscopia de fluorescencia
La espectroscopia de fluorescencia sirve como una técnica altamente sensible para investigar los estados conformacionales de las proteínas. Entre los aminoácidos, la fenilalanina (Phe), la tirosina (Tyr) y el triptófano (Trp) exhiben fluorescencia intrínseca; sin embargo, sólo Tyr y Trp se emplean de forma rutinaria en entornos experimentales debido a sus rendimientos cuánticos suficientemente altos, que generan señales de fluorescencia robustas. Tanto Trp como Tyr se excitan con una longitud de onda de 280 nm, mientras que Trp solo puede excitarse con una longitud de onda de 295 nm. Dada su naturaleza aromática, los residuos de Trp y Tyr se sitúan frecuentemente dentro del núcleo hidrofóbico de las proteínas, ya sea total o parcialmente enterrados, o en las interfaces entre dominios proteicos o subunidades oligoméricas. En entornos tan apolares, estos residuos muestran rendimientos cuánticos elevados y, en consecuencia, altas intensidades de fluorescencia. Por el contrario, cuando se altera la estructura terciaria o cuaternaria de una proteína, estas cadenas laterales quedan más expuestas al entorno hidrófilo del disolvente, lo que da como resultado una reducción de sus rendimientos cuánticos y, por tanto, menores intensidades de fluorescencia. Específicamente para los residuos de Trp, la longitud de onda de su emisión de fluorescencia máxima también depende de su entorno local.
La espectroscopia de fluorescencia es aplicable para caracterizar el desarrollo del equilibrio de las proteínas cuantificando los cambios en la intensidad de la emisión de fluorescencia o la longitud de onda de emisión máxima en función de un desnaturalizante. Los desnaturalizantes pueden abarcar varios factores, incluidos agentes químicos (p. ej., urea, clorhidrato de guanidinio), temperatura, pH o presión. El equilibrio entre los distintos estados proteicos (específicamente, los estados nativo, intermedio y desplegado) depende de la concentración o el valor del desnaturalizante. En consecuencia, la señal de fluorescencia global de su mezcla en equilibrio también varía con este parámetro. Esta metodología produce un perfil que correlaciona la señal global de fluorescencia de proteínas con el valor desnaturalizante. El análisis de dichos perfiles de desarrollo en equilibrio puede facilitar la detección e identificación de intermediarios en el desarrollo. Hugues Bedouelle ha formulado ecuaciones generales para derivar parámetros termodinámicos que caracterizan el desarrollo de equilibrios para proteínas homoméricas o heteroméricas, incluidos trímeros y potencialmente tetrámeros, a partir de estos perfiles. Además, la espectroscopia de fluorescencia se puede integrar con técnicas de mezcla rápida, como métodos de flujo detenido, para investigar la cinética de plegamiento de proteínas, construir gráficos de chevron y realizar análisis del valor Phi.
Dicroísmo circular
El dicroísmo circular (CD) se erige como una técnica fundamental y ampliamente aplicable para investigar el plegamiento de proteínas. La espectroscopia CD cuantifica la absorción diferencial de luz polarizada circularmente. Dentro de las proteínas, las estructuras secundarias quirales, incluidas las hélices alfa y las láminas beta, absorben este tipo de luz. El grado de esta absorción sirve como indicador del plegamiento general dentro de un conjunto de proteínas. Este método se ha empleado para evaluar el desarrollo del equilibrio de las proteínas mediante el seguimiento de los cambios en la absorción en función de la concentración o la temperatura del desnaturalizante. Un experimento de fusión desnaturalizante produce la energía libre de despliegue y el valor 'm' de la proteína, que refleja su dependencia del desnaturalizante. Por el contrario, un experimento de temperatura de fusión determina la temperatura de desnaturalización de la proteína (Tm). De manera similar a la espectroscopia de fluorescencia, la espectroscopia de dicroísmo circular se puede combinar con instrumentos de mezcla rápida, como sistemas de flujo detenido, para analizar la cinética de plegamiento de proteínas y construir diagramas de chevron.
Dicroísmo circular vibratorio de proteínas
Los avances recientes en las técnicas de dicroísmo circular vibratorio (VCD) para proteínas, en particular aquellas que incorporan instrumentación de transformada de Fourier (FT), ofrecen metodologías sólidas para dilucidar las conformaciones de proteínas en solución, incluso para moléculas de proteínas excepcionalmente grandes. Estas investigaciones VCD de proteínas se pueden combinar sinérgicamente con datos de difracción de rayos X de cristales de proteínas, datos FT-IR obtenidos de soluciones de proteínas en agua pesada (D2O) o análisis computacionales cuánticos.
Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se emplea para adquirir datos estructurales de proteínas sometiendo muestras de proteínas concentradas a un campo magnético. En un experimento de RMN, núcleos específicos absorben distintas radiofrecuencias, un fenómeno que depende de su entorno químico. Dado que las alteraciones estructurales de las proteínas ocurren en escalas de tiempo que van desde nanosegundos (ns) a milisegundos (ms), la RMN es particularmente adecuada para investigar estructuras intermedias dentro del rango de picosegundos (ps) a segundos (s). Las técnicas clave utilizadas para analizar la estructura de las proteínas y los cambios estructurales que no se pliegan abarcan COSY, TOCSY, HSQC, relajación temporal (T1 y T2) y efecto Overhauser nuclear (NOE). NOE es particularmente ventajoso ya que permite la observación de transferencias de magnetización entre átomos de hidrógeno espacialmente próximos. Varios experimentos de RMN exhiben diferentes niveles de sensibilidad a escalas temporales, lo que los hace apropiados para diversos cambios estructurales de proteínas. Si bien NOE puede detectar vibraciones de enlaces o rotaciones de cadenas laterales, su alta sensibilidad lo hace inadecuado para observar el plegamiento de proteínas, que ocurre en escalas de tiempo más largas.
Dado que el plegamiento de proteínas normalmente ocurre dentro de un período de tiempo de aproximadamente 50 a 3000 s−1, la dispersión por relajación Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) y la transferencia de saturación de intercambio químico (CEST) han surgido como técnicas principales para el análisis de procesos de plegamiento basado en RMN. Además, ambas metodologías son fundamentales para identificar estados intermedios excitados dentro del panorama de plegamiento de proteínas. La dispersión de relajación CPMG aprovecha el fenómeno del eco de espín, en el que los núcleos objetivo se someten a un pulso de 90 grados seguido de uno o más pulsos de 180 grados. El posterior reenfoque de los núcleos, caracterizado por una amplia distribución, significa la participación de los núcleos diana en un estado excitado intermedio. El análisis de los gráficos de dispersión de relajación produce datos termodinámicos y cinéticos relacionados con las transiciones entre los estados excitado y fundamental. Por el contrario, la transferencia de saturación cuantifica las alteraciones de la señal del estado fundamental a medida que los estados excitados sufren perturbaciones. Esta técnica emplea irradiación de radiofrecuencia débil para saturar el estado excitado de un núcleo específico, transfiriendo así su saturación al estado fundamental. La señal resultante se amplifica mediante una reducción de la magnetización (y, en consecuencia, de la señal) del estado fundamental.
Una limitación principal de la espectroscopia de RMN es la reducción en la resolución observada con proteínas que superan los 25 kDa, lo que la hace menos detallada que la cristalografía de rayos X. Además, el análisis de los datos de RMN de proteínas presenta desafíos importantes, y a menudo produce múltiples soluciones estructurales plausibles de un solo espectro.
Un estudio que investiga el plegamiento de la superóxido dismutasa 1 (SOD1), una proteína implicada en la esclerosis lateral amiotrófica, utilizó dispersión de relajación y transferencia de saturación para examinar estados intermedios excitados. SOD1 se había asociado previamente con numerosos mutantes causantes de enfermedades, que se suponía que contribuían a la agregación de proteínas, aunque el mecanismo subyacente seguía siendo difícil de alcanzar. Mediante la aplicación de experimentos de dispersión de relajación y transferencia de saturación, se identificaron múltiples estados intermedios excitados indicativos de plegamiento incorrecto en los mutantes SOD1.
Interferometría de doble polarización
La interferometría de doble polarización (DPI) constituye una técnica sensible a la superficie diseñada para cuantificar las características ópticas de las capas moleculares. En el contexto de la caracterización del plegamiento de proteínas, DPI evalúa la conformación de las proteínas determinando las dimensiones generales y la densidad de una monocapa de proteínas en tiempo real, logrando una resolución sub-Angstrom. Sin embargo, las mediciones cinéticas en tiempo real del plegamiento de proteínas están restringidas a procesos que ocurren a velocidades inferiores a aproximadamente 10 Hz. De manera análoga al dicroísmo circular, el plegamiento de proteínas puede ser inducido por estímulos como desnaturalizantes o cambios de temperatura.
Estudios de alta resolución temporal del plegamiento de proteínas
En los últimos años se han logrado avances significativos en la investigación del plegamiento de proteínas mediante la llegada de metodologías rápidas y resueltas en el tiempo. Los investigadores emplean estas técnicas para iniciar rápidamente el plegamiento de muestras de proteínas desplegadas y posteriormente monitorear la dinámica resultante. Las técnicas rápidas actuales abarcan la mezcla de soluciones ultrarrápida, enfoques fotoquímicos y espectroscopia de salto de temperatura con láser. Los científicos notables que han contribuido al avance de estas técnicas incluyen a Heinrich Roder, Terry Oas, Harry Gray, Martin Gruebele, Brian Dyer, William Eaton, Sheena Radford, Chris Dobson, Alan Fersht, Bengt Nölting y Lars Konermann.
Proteólisis
La proteólisis se emplea de forma rutinaria para determinar la fracción de proteína desplegada en diversas condiciones de solución, ejemplificada por técnicas como la proteólisis paralela rápida (FASTpp).
Espectroscopia de fuerza de una sola molécula
Se han empleado metodologías de molécula única, como pinzas ópticas y microscopía de fuerza atómica (AFM), para dilucidar los mecanismos de plegamiento de proteínas tanto de las proteínas aisladas como de aquellas que interactúan con las chaperonas. Las pinzas ópticas, por ejemplo, facilitan el estiramiento de moléculas de proteínas individuales desde sus extremos C y N, induciendo el despliegue para permitir investigaciones posteriores sobre el replegamiento. Esta técnica permite medir las tasas de plegamiento con una resolución de una sola molécula; una aplicación reciente implicó estudiar la dinámica de plegado y despliegue de proteínas cruciales para la coagulación sanguínea. Específicamente, se descubrió que el factor von Willebrand (vWF), una proteína vital para la formación de coágulos sanguíneos, mediante mediciones con pinzas ópticas de una sola molécula, funciona como un sensor de fuerza de corte en el torrente sanguíneo cuando se une al calcio. La fuerza de corte desencadena el despliegue del dominio A2 del vWF, cuya velocidad de replegamiento se acelera significativamente en presencia de calcio. Además, investigaciones recientes han demostrado que el dominio src SH3 relativamente simple puede acceder a múltiples vías de desarrollo cuando se somete a fuerza mecánica.
Pintura con Biotina
La técnica de pintura con biotina proporciona instantáneas celulares de proteínas específicas de cada condición en sus estados plegados o desplegados. Este método muestra un sesgo notable hacia las proteínas que se predice que están intrínsecamente desordenadas.
Estudios computacionales del plegamiento de proteínas
Las investigaciones computacionales sobre el plegamiento de proteínas abarcan tres áreas principales: predecir la estabilidad, la cinética y la estructura de las proteínas. Una revisión exhaustiva publicada en 2013 proporciona una descripción general de las metodologías computacionales disponibles para el análisis del plegamiento de proteínas.
La paradoja de Levinthal
En 1969, Cyrus Levinthal observó que una cadena polipeptídica desplegada posee un número excepcionalmente grande de grados de libertad, lo que conduce a una cantidad astronómica de conformaciones potenciales. Una de sus publicaciones estimó que este número era 3300 o 10143. La paradoja de Levinthal es una construcción teórica basada en la premisa de que si una proteína se plegara muestreando secuencialmente cada conformación posible, el proceso requeriría una duración astronómica, incluso si las conformaciones se muestrearan a un ritmo rápido (escala de nanosegundos o picosegundos). Dado que las proteínas se pliegan considerablemente más rápido que este período de tiempo teórico, Levinthal propuso que no se produce una búsqueda conformacional aleatoria; en cambio, las proteínas deben plegarse a través de una serie de estados intermedios metaestables.
Panorama energético del plegamiento de proteínas
El espacio conformacional atravesado por una proteína durante su proceso de plegamiento puede conceptualizarse como un paisaje energético. Según Joseph Bryngelson y Peter Wolynes, las proteínas se adhieren al principio de frustración mínima, lo que implica que las proteínas evolucionadas naturalmente han optimizado sus paisajes de energía de plegamiento. Esta optimización sugiere que la selección natural ha favorecido secuencias de aminoácidos donde el estado plegado de la proteína es suficientemente estable y la consecución de este estado plegado es un proceso suficientemente rápido. Aunque la naturaleza ha reducido el nivel de frustración en las proteínas, cierto grado de ella persiste, como lo demuestra la presencia de mínimos locales dentro del paisaje energético de las proteínas.
Una consecuencia directa de estas secuencias evolutivamente seleccionadas es la noción ampliamente aceptada de que las proteínas generalmente poseen "paisajes energéticos canalizados" globalmente, un término acuñado por José Onuchic. Estos paisajes están en gran medida dirigidos al estado natal. Este modelo de "embudo de plegado" postula que una proteína puede plegarse a su estado nativo a través de numerosas vías y configuraciones intermedias, en lugar de limitarse a un mecanismo singular. Esta teoría está respaldada tanto por simulaciones computacionales de proteínas modelo como por investigaciones experimentales, y ha sido fundamental para perfeccionar métodos para la predicción y el diseño de la estructura de proteínas. Además, describir el plegamiento de proteínas a través de un paisaje nivelador de energía libre se alinea con la segunda ley de la termodinámica. Desde una perspectiva física, visualizar paisajes únicamente en términos de superficies de energía potencial o total con máximos, puntos de silla, mínimos y embudos, similares a los terrenos geográficos, puede resultar algo engañoso. La descripción pertinente realmente implica un espacio de fase de alta dimensión donde las variedades pueden adoptar una variedad de formas topológicas más complejas.
La cadena polipeptídica desplegada inicia su proceso de plegado en el vértice del embudo de energía, un estado caracterizado por el máximo número de variaciones conformacionales y el mayor nivel de energía. Estos paisajes energéticos ilustran una multitud de posibilidades conformacionales iniciales, pero convergen en un estado nativo singular, sin dilucidar las diversas vías de plegamiento que pueden conducir a él. Moléculas distintas de una proteína idéntica pueden atravesar vías de plegamiento ligeramente variadas, explorando diferentes intermediarios de baja energía, siempre que se alcance la estructura nativa definitiva. La frecuencia de utilización de la vía depende de la favorabilidad termodinámica inherente a cada vía específica. En consecuencia, es probable que se emplee con mayor frecuencia una vía termodinámicamente más favorable en la progresión hacia la estructura nativa. A medida que la proteína se pliega y adopta varias conformaciones, realiza una transición constante hacia estructuras termodinámicamente más estables, descendiendo así por el embudo de energía. La aparición de estructuras secundarias significa un aumento sustancial en la estabilidad de la proteína, con sólo una combinación específica de estructuras secundarias dentro de la columna vertebral del polipéptido que posee la energía más baja, definiendo así el estado nativo de la proteína. Entre las estructuras iniciales que se materializan durante el plegamiento del polipéptido se encuentran las hélices alfa y los giros beta, donde las hélices alfa se forman rápidamente, a menudo en 100 nanosegundos, y los giros beta en 1 microsegundo.
Dentro del panorama del embudo de energía, un punto de silla representa el estado de transición para una proteína específica. Este estado de transición, como se muestra en el diagrama del embudo de energía, constituye la conformación obligatoria que toda molécula de proteína debe adoptar para alcanzar su estructura nativa. Se excluye el logro de la estructura nativa sin atravesar previamente este estado de transición. El estado de transición a menudo se caracteriza como una forma incipiente o precursora del estado nativo, más que simplemente como un paso intermedio. La formación del estado de transición se reconoce como el paso determinante de la velocidad en el plegamiento de proteínas; a pesar de su estado de mayor energía en comparación con el pliegue nativo, exhibe una similitud estructural significativa con la conformación nativa. Fundamentalmente, el estado de transición abarca un núcleo, alrededor del cual la proteína inicia el plegamiento a través de un mecanismo denominado "condensación de nucleación", en el que la estructura colapsa progresivamente sobre este núcleo central.
Modelado computacional del plegamiento de proteínas
La predicción computacional de la estructura de proteínas emplea con frecuencia técnicas de novo o ab initio para simular diversas facetas del plegamiento de proteínas. Las simulaciones de dinámica molecular (MD) han sido fundamentales en la investigación computacional del plegamiento y la dinámica de proteínas. Las simulaciones iniciales de plegamiento del equilibrio normalmente utilizaban modelos de solventes implícitos y metodologías generales de muestreo. Debido a importantes demandas computacionales, las simulaciones de plegamiento MD ab initio que incorporan agua explícita generalmente están restringidas a péptidos y proteínas más pequeñas. Para proteínas más grandes, las simulaciones de MD se limitan principalmente a analizar la dinámica de estructuras determinadas experimentalmente o sus procesos de despliegue a alta temperatura. Los procesos de plegado extendido, que superan aproximadamente 1 milisegundo, particularmente para proteínas más grandes (por ejemplo, aquellas con más de 150 residuos), se pueden explorar de manera efectiva utilizando modelos de grano grueso.
Numerosas iniciativas computacionales a gran escala, incluidas Rosetta@home, Folding@home y Foldit, están dedicadas a abordar los desafíos del plegamiento de proteínas.
Se han ejecutado simulaciones extendidas de trayectoria continua en Anton, una supercomputadora masivamente paralela desarrollada por D. E. Shaw Research, que presenta interconexiones y ASIC personalizados. En 2011, la simulación publicada más prolongada realizada en Anton alcanzó una duración de 2,936 milisegundos para NTL9 a 355 K. Estas simulaciones avanzadas actualmente permiten el desarrollo y replegamiento del equilibrio de proteínas pequeñas (que comprenden menos de 150 residuos de aminoácidos) y facilitan las predicciones sobre el impacto de las mutaciones en la cinética de plegamiento y la estabilidad.
En 2020, un equipo de investigación que utilizó AlphaFold, un programa de inteligencia artificial (IA) desarrollado por DeepMind para la predicción de estructuras de proteínas, consiguió la primera posición en CASP, una competición de predicción de estructuras destacada y establecida desde hace mucho tiempo. Este equipo demostró un nivel de precisión sin precedentes, superando significativamente a todos los demás grupos participantes. Específicamente, sus predicciones alcanzaron puntuaciones superiores al 90% para aproximadamente dos tercios de las proteínas evaluadas en la prueba de distancia global (GDT) de CASP. La métrica GDT cuantifica la semejanza estructural entre un modelo predicho computacionalmente y su contraparte determinada empíricamente a partir de experimentos de laboratorio. Una puntuación perfecta de 100 en el GDT significa una congruencia estructural completa, dependiendo del límite de distancia especificado empleado en el cálculo.
Los resultados de predicción de la estructura de proteínas logrados por AlphaFold en CASP obtuvieron descripciones como "transformacionales" y "asombrosos". Sin embargo, algunos investigadores observaron que la precisión predictiva seguía siendo insuficiente para un tercio de sus predicciones. Además, destacaron que AlphaFold no aclara los mecanismos físicos subyacentes del plegamiento de proteínas, un requisito previo para considerar el problema del plegamiento de proteínas completamente resuelto. A pesar de estas reservas, el desempeño de AlphaFold es ampliamente reconocido como un logro sustancial en biología computacional, que representa un avance considerable hacia la resolución del gran desafío de décadas dentro de la biología: la predicción precisa de las estructuras de las proteínas.
Referencias
Referencias
- Proyecto de plegado del proteoma humano